リファレンスゲノムの読み方
なぜこの概念が必要なのか
ゲノム解析結果には chr7:... のような位置が頻繁に現れます。しかし、染色体名と数字だけでは完全な住所にはなりません。どのゲノムアセンブリを基準にした座標なのかが分からなければ、同じ配列領域やバリアントを特定できません。
リファレンスゲノムは単なる「代表的なヒトDNA配列」ではありません。シーケンシングリードをアラインし、バリアントや遺伝子featureを記録し、結果を交換するための配列ベースの座標系です。解析開始時にreferenceを固定しなければ、後続の座標、annotation、解析resourceが互いに一致しなくなる可能性があります。
Referenceは1つのFASTAファイルだけではない
| 層 | 固定すべき情報 | 変わった場合の問題 |
|---|---|---|
| assembly | GRCh37、GRCh38、T2T-CHM13など | 同じ位置番号が異なる配列を指す可能性がある |
| assembly release | major・patchとaccession/version | 含まれるsequenceとreleaseが曖昧になる |
| reference bundle | primary、alternate、decoyなどのFASTA構成 | read mappingやvariant callが変わり得る |
| annotation | provider、release、GTF/GFF | gene・transcript境界やconsequenceが変わり得る |
| analysis resources | known-sites、interval、index | contig名や座標が一致しなくなる可能性がある |
したがって、「GRCh38を使用した」という記録だけでは十分ではありません。assembly accession、FASTAと付属ファイルのversion、annotation releaseを併記する必要があります。
GRCh37、hg19、GRCh38、hg38
GRCh37とGRCh38はGenome Reference Consortiumのassembly名で、hg19とhg38はUCSCで広く使われる対応名です。GRCh19は正式なassembly名ではなく、通常はGRCh37とhg19が混ざって生じた表現です。
現在のGRC human major assemblyはGRCh38で、最新patchはGRCh38.p14です。patch releaseはpatch sequenceを追加しますが、major assemblyの染色体座標は変更しません。一方、GRCh37からGRCh38へのmajor assembly変更では、座標と配列contextを再確認する必要があります。
Assemblyが変われば住所だけを置き換えればよいのか
必ずしもそうではありません。一意に対応する保存領域は比較的簡単に変換できますが、反復配列、segmental duplication、構造差、新規領域では、unmapped・multi-mapped feature、intervalやstrandの変化、reference alleleの不一致が起こり得ます。
UCSC LiftOverやEnsembl Assembly Converterはassembly alignmentを用いて座標を投影します。変換成功は生物学的同一性を保証しません。mapping、interval、strand、allele、target annotationを検証し、複雑な領域では元のreadをtarget referenceへ再アラインする方が妥当な場合があります。
source assemblyとreference alleleを確認
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target assemblyと変換方法を固定
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unmapped / multi-mapped / changed intervalを検証
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target alleleとannotation releaseを再確認KOREFは何を加えるのか
2016年のKOREF研究は、1人のdonorに基づくKOREF_Sと、40人の韓国人高深度ゲノムのcommon variantを反映したKOREF_Cを提示しました。その目的はGRCh38に代わる単一の韓国人標準を作ることではなく、集団に関連する配列と変異表現が韓国人・東アジア人の解析を補完できるかを評価することでした。
後続のKOREF_S1はlong read、Hi-C、parental informationを用いたchromosome-level assemblyです。そのため「KOREFを使用した」という記述には正確なreleaseが必要です。KOREFはすべての韓国人を表す単一の正常ゲノムでも、臨床標準でもありません。
T2Tとパンゲノムの後もGRCh38が使われる理由
T2T-CHM13は従来のreferenceで欠けていたgapや複雑領域を大きく拡張しました。Human Pangenome Referenceは複数人のphased assemblyとその関係を表現し、単一の線形referenceが見落とす多様性を減らそうとします。T2Tの単一assemblyと集団多様性を表すpangenomeは同じ概念ではありません。
これはGRCh38ベースの結果が自動的に無効になることを意味しません。annotation、population database、assay design、clinical knowledge、software ecosystemが特定のreferenceに結び付いているからです。重要なのは「最も新しいreference」を1つ覚えることではなく、研究課題、exact release、reference bundle、annotation、変換後の検証を明示することです。
よくある誤解
- Reference genomeは1人の完全または普遍的に正常なゲノムではありません。
- GRC patchはmajor chromosome coordinateを維持しますが、使用bundleの記録は必要です。
- 座標変換の成功はvariantの完全な同一性を示しません。
- PangenomeはGRCh38の単純な次期versionではありません。
根拠の境界
本稿はreferenceの選択と記録を説明するConceptです。特定assay、臨床variantの再解釈、実行可能な変換commandは提供しません。実践tutorialではreference bundle、annotation release、checksumを別途固定する必要があります。