qPCR CNV解析における相対定量からコピー数へ
なぜこれが重要なのか？
qPCRは、特定のDNA断片の迅速かつ比較的狭い範囲での定量を可能にし、欠失/重複候補の同定や既知の座におけるコピー数の推定を促進する。しかし、装置はコピー数を直接カウントするわけではない。代わりに、増幅が参照サンプルに対して数サイクル早くまたは遅く検出されるかを決定し、複数の前提条件が満たされる場合にこの差をコピー数として解釈することにより、相対定量を行う。
qPCRとRT-qPCRも区別されなければならない。qPCRは測定方法を指し、DNAテンプレートを利用できる。RT-qPCRは、RNAの逆転写によって生成されたcDNAを測定する。CNVがゲノムDNAから評価されるか、あるいは遺伝子発現がRNAから評価されるかによって、問いとコントロールは全く異なる。
Cqが表すもの
PCRサイクルが繰り返されるにつれて標的産物が蓄積し、蛍光が閾値を超えるサイクルがCqとして記録されます。初期テンプレート量が多いサンプルは、通常、より早期のサイクルで閾値に達します。理想的な増幅効率条件下では、1サイクルの違いは約2倍の変化に対応しますが、実際の効率はプライマー、アンプリコン、および検体に応じて異なります。
標的Cq値のみを比較すると、DNA入力量や品質の違いがコピー数変異（CNV）として誤解される可能性があります。これを回避するために、同じサンプル内の安定した参照座標との比較によりΔCqを算出し、さらに既知の二倍体キャリブレーターとの比較によりΔΔCqを計算します。この計算は、標的と参照の増幅効率が十分に類似していることを前提としています。
CNV推定の設計
アッセイ部位は、正確な検出を確保するためにCNV内に位置させる必要がある。1つのエクソンにおける欠失を検出するために設計されたプライマーが影響を受けていないエクソンに配置されている場合、サンプルが誤って正常と見なされる可能性がある。さらに、単一座位での定量PCR（qPCR）では、大きな重複の境界や方向性を決定することはできない。したがって、パターンを確認するために、アッセイは複数のエクソンまたは境界候補にわたって分散させるべきである。
参照座位は、研究対象において安定したコピー数を示し、標的と同等の品質で増幅されるものでなければならない。二倍体対照、陽性対照、および無鋳型対照を含めることが不可欠であり、技術的反復間のばらつきを評価することも必要である。標準曲線を用いた効率性とダイナミックレンジの検証も重要である。
小さな例
あるエクソンの相対的 abundance が、正常対照と比較して反復測定において約半分になっている場合で、隣接するエクソンが正常であるとき、ヘテロ接合性エクソン欠失の仮説を立てることができる。しかし、プライマー結合部位における SNV が一方のアレルの増幅を阻害し、同一のパターンを生じることがある。代替プライマーセットや MLPA/シーケンシングなどの独立した手法による確認が必要である。
2 倍のシグナル増加が観察される場合でも、qPCR のみではこれがタンデム重複 か他の座位への挿入コピーによるものかを決定できず、どのアレルが影響を受けているか同定することもできない。
MIQEおよび記録すべき情報
再現性のあるqPCRには、サンプル抽出法、DNAの品質と量、プライマー配列またはアッセイID、増幅産物の特性、効率、閾値設定、反復数、除外基準、計算方法の文書化が必要である。結果値のみを保持すると、他のラボが同じコピー数判定を再現するのが困難になる。
キャリブレーターとコントロールは各バッチに含め、プレート位置およびオペレーターの効果の評価を行うべきである。実際の細胞のコピー数が整数であると仮定して、分数のコピー数推定値を過大解釈してはならない。
一般的な誤解
- ΔΔCq法は、すべての条件下で普遍的に適用できる公式ではありません。
- 相対量が0.5や1.5であっても、欠失または重複事象を決定論的に示すものではありません。
- ゲノムCNV qPCRとRNA発現RT-qPCRは、互換性のあるアッセイではありません。
- 反復間の高い一致性は、系統的なプライマーバイアスの存在を除外するものではありません。
解釈上の留意点
qPCRは標的座相の相対コピー数を狭義に照会するのみであり、ブレイクポイント、複雑な再構成、腫瘍純度、モザイクを独立して解像しない。臨床的判断には、アッセイ固有の検証および独立した確認手法が必要である。
文脈における読み取り
アッセイ手法の選択と盲点の概念はWGS・WES・パネルに関連し、構造変異のアノテーションはAnnotSVに関連し、対立遺伝子頻度とモザイク性は生殖細胞系および体性VAFの概念に関連する。