scRNA-seq ha perdido sus coordenadas

Desde S26 hasta S34, se leyeron los transcriptomas de células individuales mediante scRNA-seq, se formaron clústeres, se trazaron trayectorias y se reconstruyó la comunicación intercelular. Sin embargo, todos estos análisis compartían una limitación común: no se sabe dónde estaba ubicada cada célula dentro del tejido. Dado que el scRNA-seq requiere la disociación del tejido para extraer las células una por una, es imposible determinar si una célula se encontraba en el centro de un tumor, en el límite con el tejido sano o cerca de un vaso sanguíneo.

La transcriptómica espacial recupera estas coordenadas. Mantiene intacto el corte de tejido y lee la expresión génica directamente sobre él. En esta sección, se comparan los principios y las diferencias de resolución entre las tres tecnologías más utilizadas actualmente —10x Visium, 10x Xenium y MERFISH— y se examina la estructura de almacenamiento de los datos espaciales.

Tecnología 1: Visium — Captura mediante códigos de barras por puntos

Visium es una plataforma de transcriptómica espacial basada en secuenciación de 10x Genomics. Su principio de funcionamiento es el siguiente:

1. Se coloca un corte de tejido sobre un portaobjetos con un área de captura (Capture Area) que contiene códigos de barras impresos.
2. El portaobjetos alberga aproximadamente 5.000 puntos (spots) (diámetro de 55 μm, separación de 100 μm) dispuestos en una cuadrícula, donde cada punto tiene asignado un código de barras espacial único.
3. Al permeabilizar el tejido, el ARNm se libera y queda capturado por los códigos de barras subyacentes.
4. El ARNm capturado se transcribe inversamente a ADNc y se secuencia. Dado que cada lectura conserva su código de barras espacial, es posible rastrear el punto de origen de cada lectura.

El resultado es una matriz de punto × gen, cuya estructura es idéntica a la matriz célula × gen de scRNA-seq, pero donde la unidad de observación es el "punto" en lugar de la "célula".

Limitación de Visium: resolución

Un punto de 55 μm suele contener entre 1 y 10 células. Por lo tanto, la expresión de un solo punto es una mezcla (mixture) de múltiples células. Esto no es resolución de célula única, sino una "resolución espacial aproximada". La deconvolución de esta mezcla se aborda en S37.

Visium HD (2024 en adelante) ha mitigado significativamente este problema al reducir el tamaño del punto a 2 μm; sin embargo, los datos estándar de Visium siguen siendo abrumadoramente predominantes.

Tecnología 2: Xenium — Imagen de moléculas individuales sobre el tejido

Xenium es una plataforma de transcriptómica espacial basada en imagen de 10x Genomics. En lugar de secuenciación, utiliza sondas fluorescentes para visualizar directamente moléculas individuales de ARNm in situ.

1. Se sintetizan sondas basadas en amplificación por círculo rodante (RCA) para un panel de genes predefinido (de cientos de genes).
2. La sonda se hibrida con el mRNA en el tejido.
3. El microscopio de fluorescencia captura cada molécula de mRNA como un punto individual.
4. Mediante la segmentación celular, se determina a qué célula pertenece cada punto.

El resultado es una matriz célula × gen + coordenadas XY por célula + polígonos de límites celulares. A diferencia de Visium, ofrece resolución a nivel de célula individual y conserva la morfología celular.

El compromiso de Xenium: número de genes

Xenium solo mide paneles de genes predefinidos (actualmente ～500). En comparación con el transcriptoma completo de Visium (～20,000 genes), el número de genes es limitado. Por lo tanto, Visium es adecuado para el análisis exploratorio (cuando no se sabe qué genes son importantes), mientras que Xenium es adecuado para la validación de hipótesis (cuando los genes de interés ya están definidos).

Tecnología 3: El poder del codificado combinatorio en MERFISH

MERFISH (Multiplexed Error-Robust FISH) es un método basado en imagen desarrollado por el equipo de Zhuang en Harvard. Utiliza imágenes de fluorescencia, de forma similar a Xenium, pero la diferencia clave es el codificado combinatorio.

Aunque solo haya 4 canales de fluorescencia, se asigna un patrón único de ON/OFF (código binario) a cada gen durante N rondas de captura continua. Si se seleccionan solo los códigos con capacidad de corrección de errores entre las $2^N$ combinaciones posibles (distancia de Hamming ≥ 2), es posible medir simultáneamente miles de genes.

Cómo elegir la tecnología adecuada

El criterio empírico es el siguiente. Si "aún no se sabe qué genes son importantes", primero se escanea el transcriptoma completo con Visium. Una vez que los genes de interés se han reducido, se validan con Xenium o MERFISH a resolución de célula/molécula individual. Combinar estas dos etapas es el diseño más robusto.

Estructura AnnData de los datos espaciales

Los datos espaciales también se almacenan en el framework Scanpy/AnnData. La diferencia clave es que adata.obsm["spatial"] incluye las coordenadas XY.

import scanpy as sc
import squidpy as sq

# Cargar datos de ejemplo de Visium
adata = sq.datasets.visium_hne_adata()

# Verificar coordenadas espaciales
print(adata.obsm["spatial"].shape)  # (n_spots, 2)

# Superposición de expresión génica sobre imagen H&E
sc.pl.spatial(adata, color="Mbp", spot_size=1.5)

sc.pl.spatial superpone la expresión de cada spot con colores sobre la imagen de tinción H&E. En el tejido cerebral, se observaría que Mbp (proteína de mielina) se concentra en las regiones de la sustancia blanca; esta es la primera intuición de cómo la expresión génica coincide con la estructura anatómica.

Estructura del slot espacial de AnnData

adata.obsm["spatial"]        # coordenadas (n, 2)
adata.uns["spatial"]         # factor de escala, ruta de la imagen
adata.uns["spatial"]["V1_Human_Brain"]["images"]  # matriz de imágenes H&E
adata.uns["spatial"]["V1_Human_Brain"]["scalefactors"]  # tamaño del punto, escala de la imagen

Los datos de Xenium/MERFISH incluyen adicionalmente las coordenadas del centro celular en adata.obs["cell_id"], adata.obsm["spatial"], y los polígonos de los límites celulares en adata.uns. La estructura es la misma; solo cambia la unidad de observación de spot a célula.

Mapeo CS

• Gráficos raster vs. vectoriales: Los spots de la cuadrícula fija de Visium corresponden a los píxeles de una imagen raster, mientras que las coordenadas moleculares individuales de Xenium/MERFISH corresponden a los puntos de un gráfico vectorial. El compromiso (trade-off) entre resolución y capacidad es el mismo.
• Mapa de hash de códigos de barras: El mapeo de código de barras espacial de Visium $\rightarrow$ spot es similar a una búsqueda en una tabla hash. Al no haber colisiones de códigos de barras, se trata de un hashing perfecto.
• Codificación combinatoria / Código de Hamming: El código de barras binario y la corrección de errores de MERFISH siguen el mismo principio que el código de Hamming en la teoría de la información. Esto se conecta directamente con los códigos de corrección de errores de DryBench.

Defectos comunes

• Interpretar un spot de Visium como una sola célula: Dado que un solo spot contiene múltiples células, no se debe asumir que la expresión del spot pertenece a un tipo celular específico. Se requiere deconvolución (S37).
• Fallo en el registro (registration) de imágenes: Si las coordenadas de la imagen H&E y los datos de expresión no coinciden, todo el análisis espacial carece de sentido. Verifique siempre tissue_positions.csv en la salida de Space Ranger.
• Errores de segmentación celular en Xenium: En tejidos densos, si los límites celulares se detectan incorrectamente, el ARNm de las células vecinas se asigna a una sola célula. Primero, verifique las métricas de calidad de la segmentación.
• Autofluorescencia en tecnologías basadas en imagen: Si la autofluorescencia del tejido se superpone con la señal de la sonda, aumentan los falsos positivos. Se debe prestar atención a la selección de canales fluorescentes según el tipo de tejido.

Para profundizar más

El texto principal es una narrativa reconstruida directamente por BPD. Para profundizar, utilice las fuentes canónicas siguientes:

• Artículo original (Premio Nobel en transcriptómica espacial): Ståhl et al. (2016), Visualization and analysis of gene expression in tissue sections by spatial transcriptomics, Science 353:78. Es la base del Premio Nobel de Química de 2023.
• Artículo original (MERFISH): Chen et al. (2015), Spatially resolved, highly multiplexed RNA profiling in single cells, Science 348:aaa6090.
• Documentación oficial de 10x Visium: 10x Genomics Support (support.10xgenomics.com) — Guía del pipeline Space Ranger y formatos de datos.
• Benchmark: Moses & Bhatt (2022), Museum of spatial transcriptomics, Nature Methods 19:534. Es un mapa integral para la comparación de tecnologías.
• Referencia libro web gratuito: Single-cell best practices (sc-best-practices.org) — Capítulo de Spatial Omics.

Ahora que ya sabe qué son los datos espaciales, en la siguiente entrega S36 realizaremos análisis estadístico espacial sobre estos datos — composición de tipos celulares vecinos, autocorrelación espacial y coexistencia espacial de ligando-receptor — utilizando Squidpy y Giotto.