완전 게놈의 시대

2022년 T2T(Telomere-to-Telomere) 컨소시엄이 최초로 사람 게놈을 갭 없이 완성했습니다. 반복 서열의 늪이었던 텔로미어·센트로미어까지 전부 이어붙였습니다. 이 성취를 뒷받침한 도구가 몇 개 있는데, 그중 hifiasm이 사실상 표준으로 자리잡았습니다.

이 편은 Micro Tier 어셈블리 시리즈(M22 OLC → M23 De Bruijn → M24 hifiasm)의 왕관입니다. 지금까지 배운 그래프 이론이 어떻게 최신 실전 도구로 결실을 맺는지 확인합니다.

hifiasm이 특별한 이유

hifiasm(Cheng et al., Nature Methods 2021)의 두 가지 결정적 특징이 있습니다.

1. HiFi 리드 특화: PacBio HiFi(Q20+ 정확도, 10～25kb 길이)의 특성을 정밀하게 활용
2. 다이플로이드 조립 완전 지원: 부·모 haplotype을 분리해서 두 개의 완전한 조립본을 산출

앞선 롱리드 어셈블러들(Canu, Falcon)은 haploid consensus만 만들었습니다. 부·모 유전체가 섞인 하나의 평균 서열. hifiasm은 처음부터 두 haplotype을 그래프에 남긴 채 어셈블합니다.

HiFi 리드의 통계적 특성

일반 PacBio CLR 리드는 오류율 15%. Nanopore는 5～15%. HiFi는 0.1% 미만 (Q30+). 이 정확도가 어셈블리 알고리즘 설계를 근본적으로 바꿉니다.

• 리드 사이 오버랩을 거의 무결한 형태로 감지 가능 (M22 OLC의 병목이었던 오류 관리가 크게 완화)
• 반복 서열도 리드 하나가 span하면 정확히 구분됨
• 다이플로이드에서 SNV 하나만 있어도 두 haplotype이 구별됨

HiFi의 통계적 특성이 hifiasm의 string graph 접근을 가능하게 했습니다. 이건 M22에서 언급한 Myers의 이론적 뿌리로 되돌아간 셈입니다.

String graph 재해석 — Bubble 대신 phasing

M23에서 De Bruijn 그래프의 bubble은 오류로 판정하고 잘라냈습니다. hifiasm은 반대로 bubble을 살립니다.

왜냐면 다이플로이드 유전체에서 bubble은 대부분 부·모 haplotype의 차이입니다. 이걸 삭제하면 정보 손실. 대신 bubble을 두 가지 대안 경로로 유지하고, phasing 알고리즘으로 어느 경로가 부·모 중 어느 쪽인지 결정합니다.

Phasing 정보 소스는 세 가지입니다.

• Trio binning: 부모 두 명의 시퀀싱 데이터로 리드를 부·모 특이 그룹으로 분류 (가장 정확)
• Hi-C: 물리적으로 가까운 서열이 같은 haplotype에 있을 확률로 phasing
• Strand-seq: 자매 염색분체의 방향성 정보

Trio binning이 있으면 hifiasm은 거의 완벽한 다이플로이드를 만듭니다. 부·모 각각의 haplotype이 T2T 수준까지 이어집니다.

hifiasm 실행 — 세 가지 모드

Mode 1 — HiFi 단독 조립:

hifiasm -o output_prefix -t 32 sample.hifi.fastq.gz

haploid consensus 출력만 원할 때. 결과 .p_ctg.gfa 하나가 주 결과입니다.

Mode 2 — Trio binning (부모 시퀀싱 필요):

# 1) 부·모 시퀀싱(짧은 리드로도 됨)에서 특이 k-mer 뽑기
yak count -k31 -b37 -t16 -o mother.yak mother.R1.fq.gz mother.R2.fq.gz
yak count -k31 -b37 -t16 -o father.yak father.R1.fq.gz father.R2.fq.gz

# 2) hifiasm에 부·모 정보 전달
hifiasm -o child.trio -t 32 \
  -1 father.yak -2 mother.yak \
  child.hifi.fastq.gz

결과에 .hap1.p_ctg.gfa와 .hap2.p_ctg.gfa 두 개. 각각 부·모 haplotype의 완전 조립본입니다.

Mode 3 — Hi-C 페어드 조립:

hifiasm -o output_prefix -t 32 \
  --h1 hic.R1.fastq.gz --h2 hic.R2.fastq.gz \
  sample.hifi.fastq.gz

부모 시퀀싱은 없지만 Hi-C 데이터가 있을 때. Trio binning보다 정확도는 낮지만 여전히 다이플로이드 조립.

GFA 포맷 — 그래프 자체를 출력하는 이유

hifiasm의 주 출력은 FASTA가 아니라 GFA (Graphical Fragment Assembly) 포맷입니다. contig 서열뿐 아니라 assembly graph의 전체 위상을 담습니다.

H       VN:Z:1.0
S       s1      ACGTACGT...    LN:i:12345
S       s2      GTACGTAC...    LN:i:12000
L       s1      +       s2      +       50M
L       s1      +       s3      -       60M

• S: 세그먼트 (contig 서열)
• L: 링크 (두 세그먼트 사이 오버랩·방향성)

이 포맷은 다중 대안 경로를 표현합니다. 나중에 phasing이나 큐레이션 도구가 그래프 위상을 참조해서 판단할 수 있습니다. FASTA는 이 정보를 잃습니다.

시각화는 Bandage 도구로 하는 게 표준입니다. 그래프 위상을 눈으로 보면 어셈블리의 병목이 어디인지 즉시 알 수 있습니다.

실습 — E. coli HiFi 조립

E. coli는 게놈이 작아서(~5Mb) 노트북에서도 됩니다.

# hifiasm 설치 (compile 필요)
git clone https://github.com/chhylp123/hifiasm
cd hifiasm && make
./hifiasm --version

# 공개 HiFi 데이터 (E. coli K-12)
wget https://sra-pub-src-1.s3.amazonaws.com/SRR11434954/m64011_190830_220126.subreads.bam.1

# 실제로는 subreads.bam → CCS로 HiFi 만드는 단계가 있지만
# 예제용 이미 HiFi 처리된 FASTQ를 쓰는 것이 편합니다
# (또는 짧은 시뮬레이션 데이터로 테스트)

# 조립 실행 (single mode)
./hifiasm -o ecoli -t 8 ecoli.hifi.fastq.gz

# 결과 GFA → FASTA 변환
awk '/^S/{print ">"$2;print $3}' ecoli.p_ctg.gfa > ecoli.contigs.fasta

# 통계
grep -c "^>" ecoli.contigs.fasta        # contig 개수
awk '/^>/{next}{sum+=length($0)}END{print sum}' ecoli.contigs.fasta   # 총 길이

이상적으로는 E. coli는 하나의 원형 contig로 완성됩니다. 실제 실행 결과가 여러 contig로 잘려있다면, 리드 커버리지 부족이나 반복 영역 걸림이 원인입니다.

사람 게놈 스케일 — HPRC와 T2T

Human Pangenome Reference Consortium(HPRC)은 hifiasm을 사용해 47명의 다이플로이드 게놈을 완성해서 pangenome을 구축했습니다. 각 개인의 조립본은.

• HiFi 커버리지 30～40×
• Trio binning으로 부·모 haplotype 분리
• hifiasm 실행: 32-core 서버에서 며칠

결과 각 haplotype이 contig N50 40～60Mb 수준. 인간 염색체 하나가 통째로 이어지는 규모입니다. 이 데이터가 지금 pangenome 시대의 재료입니다.

T2T-CHM13(2022)은 CHM13 세포주(homozygous, 다이플로이드 아님)를 사용해서 phasing 부담을 없앤 채 갭 없는 조립을 완성했습니다. hifiasm + Verkko(Nurk et al. 2020) 조합. 사람 게놈이 21년 만에 진짜 완성된 순간입니다.

복잡도

• 오버랩 감지: minimap2 기반. O((N+L) log L)
• String graph 구축: O(엣지 수)
• Phasing: O(bubble 수 × 리드 지지 정보) — 하드하지만 실전 다항 시간
• 총: 사람 게놈 30× HiFi(90GB) → 32-core 서버 3～5일

노트북에서 세균 게놈 조립은 분·시간. 사람 게놈은 서버·클러스터 스케일.

다른 롱리드 어셈블러와 비교

HiFi가 있으면 hifiasm. Nanopore ULK(ultra-long)와 hybrid가 필요하면 Verkko. Nanopore만 있으면 Flye. 세 도구가 실무의 90%를 커버합니다.

CS 매핑 — 그래프의 다중 해답 표현

DryBench의 자료구조 선택 교훈이 여기서 응용됩니다.

• FASTA는 하나의 해답만 표현 (1D 문자열)
• GFA는 여러 대안 해답을 위상으로 표현 (2D 그래프)

문제가 본질적으로 여러 해답을 가진다면(다이플로이드 · 반복 · phasing), 자료구조도 그것을 표현할 수 있어야 합니다. 표현이 정보의 최대치를 결정합니다. FASTA에 담아버리면 이후 어떤 도구도 그 정보를 복원할 수 없습니다.

이 통찰은 다른 곳에도 나타납니다. 데이터베이스에서 정규화된 스키마가 정보의 관계를 보존하는 것, JSON이 CSV보다 더 많은 정보를 담는 것, PyTorch의 computational graph가 gradient를 자동 계산할 수 있는 이유 — 전부 표현이 알고리즘의 가능성 공간을 결정한다는 원리의 재현입니다.

다음 편으로 이어지는 갈래 — Micro §M.6 진입

M22～M24로 Micro Tier §M.5 어셈블리 3편이 완결됩니다. 다음 편부터는 다중 서열 정렬과 계통수로 이어집니다.

• 다음 편 (M25): MSA — Progressive alignment (ClustalW, MAFFT) — 여러 서열을 한 번에 정렬. 계통수의 재료
• 두 편 뒤 (M26～M28): 계통수 알고리즘 3편 — NJ/UPGMA, Fitch/Sankoff, IQ-TREE 최대우도
• 이후 (M29～M30): 집단 유전학 — Coalescent theory, Wright-Fisher

어셈블리는 그래프. 계통수는 트리. 자료구조가 바뀌면서 알고리즘도 다시 재정의됩니다.

더 깊게 파고 싶다면

• Cheng, Concepcion, Feng, Zhang, Li (2021), Haplotype-resolved de novo assembly using phased assembly graphs with hifiasm, Nature Methods — hifiasm 원 논문. 이론과 실전 벤치마크.
• Nurk et al. (2022), The complete sequence of a human genome, Science — T2T 논문. 사람 게놈 완성의 여정.
• Liao et al. (2023), A draft human pangenome reference, Nature — HPRC pangenome 논문. hifiasm의 실전 성과.
• hifiasm 공식 문서: https://hifiasm.readthedocs.io/ — 옵션·모드·해석 튜토리얼.
• Wellcome Sanger — 유튜브 어셈블리 재생목록. HiFi 시대의 실전 파이프라인.

Bandage로 소규모 어셈블리의 GFA를 시각화해봅시다. 그래프의 bubble과 tip이 어떻게 생겼는지 보는 것이, 이 시리즈 마지막의 진짜 실습입니다. 다음 편부터는 뇌를 그래프에서 트리로 옮길 준비를 합시다.