Las células no toman decisiones por sí solas

En S32 analizamos las trayectorias y en S33 la velocidad para inferir la dirección de diferenciación celular. Sin embargo, aún no hemos respondido por qué las células se diferencian en esa dirección. El hecho de que una célula madre se convierta en una neurona no puede explicarse únicamente mediante programas génicos internos; es necesario que un ligando enviado por las células vecinas se una a un receptor en la superficie, desencadenando una cascada de señalización que inicia la diferenciación.

El problema es que no podemos observar directamente esta comunicación en los datos de scRNA-seq; lo único que tenemos son los niveles de expresión génica de cada célula. No obstante, si el tipo celular A expresa altos niveles del ligando X y el tipo celular B expresa altos niveles del receptor Y, podemos inferir que es probable que exista una señal X-Y en la dirección A→B. Esta es la lógica fundamental del análisis de comunicación intercelular.

En esta sección exploraremos sobre qué pruebas estadísticas se basa esta inferencia, cómo difieren las herramientas representativas CellPhoneDB y CellChat, y trazaremos directamente una red de comunicación a partir de datos de PBMC.

Principio básico: base de datos de pares ligando-receptor + prueba de expresión

El análisis de comunicación intercelular se compone principalmente de tres pasos.

Paso 1 — Preparación de la base de datos de pares ligando-receptor: Se utiliza una base de datos que recopila miles de pares L-R conocidos (por ejemplo, CXCL12-CXCR4, WNT5A-FZD5). CellPhoneDB proporciona su propia base de datos (~2.000 interacciones), mientras que CellChat ofrece CellChatDB (~3.000 interacciones, incluyendo la clasificación de vías de secreción, contacto celular y ECM).

Paso 2 — Verificación de la expresión por tipo celular: Se calcula la expresión media de cada gen para los tipos celulares agrupados (S30). Si el ligando del par L-R se expresa significativamente en el tipo celular A y el receptor en el tipo celular B, se registra como una interacción candidata.

Paso 3 — Prueba de significancia estadística: Se verifica si la combinación observada de expresión L-R podría haber surgido por azar. El método varía según la herramienta.

CellPhoneDB vs CellChat: diferencias en el enfoque

CellPhoneDB — Prueba de permutación

La estadística de CellPhoneDB es intuitiva. Se mezclan aleatoriamente las etiquetas de los tipos celulares (permutación) y se vuelve a calcular la expresión media del par L-R. Al repetir esto 1.000 veces, se genera una distribución nula; si el valor observado real es extremo en esta distribución, se considera una interacción significativa.

La ventaja es que requiere pocos supuestos. La desventaja es el alto costo computacional (1.000 permutaciones × número de pares L-R × número de pares de tipos celulares) y el hecho de no distinguir explícitamente la dirección de la interacción (A→B frente a B→A).

CellChat — Ley de acción de masas + análisis de redes

CellChat utiliza la ley de la acción de masas, un concepto tomado de la fisicoquímica. Calcula la probabilidad de comunicación, la cual es proporcional al producto de las concentraciones del ligando y del receptor, e incorpora además cofactores. Al emplear un modelo analítico en lugar de pruebas de permutación, es más rápido y permite comparar cuantitativamente la intensidad de las interacciones.

Otra ventaja de CellChat es el análisis a nivel de red. Más allá de los pares L-R individuales, resume los patrones de comunicación a nivel de vía de señalización (pathway) y determina qué tipos celulares actúan como nodos centrales (emisores/receptores/mediadores) mediante un análisis de centralidad.

NicheNet — Rastreo hasta el nivel downstream

Mientras que CellPhoneDB y CellChat se centran en "quién envía señales a quién", NicheNet da un paso más. Conecta la señal con qué genes downstream cambian realmente en la célula receptora. Utilizando una red ligando-objetivo preentrenada, predice cómo el ligando activa los factores de transcripción a través del receptor y, finalmente, qué genes diana modifica.

Ejercicio práctico: Construcción de una red de comunicación de células inmunitarias con datos PBMC

Se utiliza CellChat v2 (R). Se reconstruye la comunicación entre linfocitos T, células B, células NK y monocitos en los datos PBMC.

library(CellChat)

# Generar entrada para CellChat desde objeto Seurat
cellchat <- createCellChat(object = seurat_obj, group.by = "cell_type")

# Cargar CellChatDB (secreción + contacto celular + ECM)
CellChatDB <- CellChatDB.human
cellchat@DB <- CellChatDB

# Preprocesamiento: subconjunto de expresión + identificación L-R sobreexpresada
cellchat <- subsetData(cellchat)
cellchat <- identifyOverExpressedGenes(cellchat)
cellchat <- identifyOverExpressedInteractions(cellchat)

# Calcular probabilidad de comunicación (ley de acción de masas)
cellchat <- computeCommunProb(cellchat, type = "triMean")
cellchat <- filterCommunication(cellchat, min.cells = 10)

# Agregación a nivel de vía + cálculo de red
cellchat <- computeCommunProbPathway(cellchat)
cellchat <- aggregateNet(cellchat)

# Visualización: red completa de comunicación
netVisual_circle(cellchat@net$count, vertex.size = groupSize)

netVisual_circle genera una red circular entre los tipos de células. El grosor de las líneas es proporcional al número de interacciones, y es típico que los monocitos aparezcan como un nodo central (hub) que envía la mayor cantidad de señales.

Visualización de rutas específicas

# Comunicación intercelular de la vía MIF
netVisual_aggregate(cellchat, signaling = "MIF", layout = "chord")

# Patrones de expresión de pares L-R individuales
netVisual_bubble(cellchat, sources.use = c("Monocyte"),
                 targets.use = c("CD4_T", "CD8_T", "NK"),
                 remove.isolate = TRUE)

En el gráfico de burbujas, el tamaño de los círculos representa la probabilidad de comunicación y el color indica el valor p. Si el par MIF-CD74 muestra una señal fuerte en la dirección Monocito→Célula T, esto constituye una evidencia de señalización inmunorreguladora.

Análisis de los roles de emisor y receptor

# Clasificación de roles basada en la centralidad de la red
cellchat <- netAnalysis_computeCentrality(cellchat, slot.name = "netP")
netAnalysis_signalingRole_heatmap(cellchat, signaling = c("MIF", "CXCL"))

Este mapa de calor muestra el papel que desempeña cada tipo celular (Sender/Emisor, Receiver/Receptor, Mediator/Mediador o Influencer/Influenciador) en cada vía. Es habitual que los monocitos actúen como emisores en la mayoría de las vías, mientras que las células T presentan un patrón centrado en el papel de receptoras.

Mapeo de CS

• Grafo bipartito: Las interacciones L-R constituyen un grafo bipartito entre el conjunto de ligandos y el conjunto de receptores. Al extenderlo a pares de tipos celulares, la estructura se convierte en tripartita.
• Prueba de permutación: El label shuffling de CellPhoneDB es un ejemplo típico de prueba no paramétrica, con la misma lógica que el bootstrapping y las pruebas de permutación de DryBench.
• Centralidad de red: La clasificación de Sender/Receiver de CellChat está directamente relacionada con las centralidades de grado (degree), intermediación (betweenness) y PageRank en el grafo.

Problemas comunes

• Expresión ≠ función proteica — Una alta expresión de ARNm no garantiza que la proteína del ligando/receptor esté realmente presente en la superficie celular. Los resultados del análisis de comunicación son siempre candidatos y requieren validación experimental.
• Pruebas múltiples — Miles de pares L-R × decenas de pares de tipos celulares = cientos de miles de pruebas. Utilizar únicamente p < 0,05 sin la corrección de Benjamini-Hochberg (BH) provoca un exceso de falsos positivos.
• Desequilibrio en el número de células — Los tipos celulares raros tienen muestras pequeñas, lo que genera una mayor varianza en la media de expresión y reduce la potencia de las pruebas de permutación. Si se establece un umbral demasiado bajo para min.cells, aumenta el ruido.
• Falta de información espacial — scRNA-seq no conoce la ubicación física de las células dentro del tejido. No puede detectar interacciones dependientes del contacto (juxtacrinas) entre células que en realidad no están en contacto. Los transcriptomas espaciales de S35 compensan esta limitación.

Para profundizar

El presente texto es una narrativa reconstruida directamente por BPD. Para profundizar, utilicemos los siguientes materiales de referencia:

• Artículo original (CellChat): Jin et al. (2021), Inference and analysis of cell-cell communication using CellChat, Nature Communications 12:1088. Es la fuente original de la inferencia de comunicación basada en la ley de acción de masas.
• Artículo original (CellChat v2): Jin et al. (2024), CellChat for systematic analysis of cell-cell communication from single-cell and spatially resolved transcriptomics, Nature Protocols. Se ha añadido la comparación de múltiples condiciones y el soporte para datos espaciales.
• Artículo original (CellPhoneDB): Efremova et al. (2020), CellPhoneDB: inferring cell-cell communication from combined expression of multi-subunit ligand-receptor complexes, Nature Protocols 15:1484.
• Artículo original (NicheNet): Browaeys et al. (2020), NicheNet: modeling intercellular communication by linking ligands to target genes, Nature Methods 17:159.
• Libro web gratuito de referencia: Single-cell best practices (sc-best-practices.org) — Capítulo de comunicación intercelular.

Con esto, hemos completado los temas centrales de la serie de célula única: desde el preprocesamiento, el agrupamiento, la reducción de dimensionalidad, la corrección de lotes, las trayectorias y la velocidad, hasta la comunicación intercelular. Sin embargo, los datos de célula única tienen una limitación decisiva: no sabemos dónde se encontraban las células dentro del tejido. En el próximo episodio, S35, pasaremos a la tecnología de transcriptómica espacial (Spatial Transcriptomics), que permite leer la expresión génica en secciones de tejido, devolviéndoles las coordenadas a las células.