qPCR CNV — Cómo la cuantificación relativa se convierte en número de copias
Por qué es importante saberlo
La qPCR permite medir rápidamente y con un margen relativamente estrecho la cantidad de una región específica de ADN, por lo que se utiliza para identificar candidatos a deleción o duplicación y estimar el número de copias de un locus conocido. Sin embargo, el equipo no cuenta directamente el número de copias. Se realiza una cuantificación relativa basada en cuántos ciclos antes o después se detecta la amplificación en comparación con una muestra de referencia, y bajo ciertos supuestos, esa diferencia se interpreta como el número de copias.
También es necesario distinguir entre qPCR y RT-qPCR. La qPCR se refiere a la técnica de medición y puede utilizar ADN molde. La RT-qPCR mide cDNA obtenido mediante la transcripción inversa de ARN. Al observar las CNV en el ADN genómico frente a la expresión génica en ARN, las preguntas y los controles son completamente diferentes.
Qué significa Cq
A medida que se repiten los ciclos de PCR, aumenta el producto diana y se registra como Cq el momento en que la fluorescencia supera el umbral. Cuanta más plantilla inicial haya, generalmente se alcanza el umbral en un ciclo anterior. En una eficiencia ideal, una diferencia de un ciclo representa aproximadamente una diferencia de dos veces, pero la eficiencia real varía según los cebadores, el amplicón y la muestra.
Comparar únicamente el Cq diana puede llevar a interpretar erróneamente las diferencias en la cantidad y calidad del ADN introducido como CNV. Se debe calcular ΔCq comparando con un locus de referencia estable de la misma muestra y luego calcular ΔΔCq comparándolo nuevamente con un calibrador diploide conocido. Este cálculo requiere el supuesto de que las eficiencias de amplificación de la diana y del locus de referencia son suficientemente similares.
Diseño para la estimación de CNV
La posición del ensayo debe estar realmente incluida dentro de la CNV. Si los cebadores diseñados para detectar la deleción de un solo exón se ubican en un exón no afectado, podría parecer normal. Tampoco es posible determinar el límite completo y la dirección de la disposición de una duplicación grande con un solo ensayo de qPCR. Se pueden colocar ensayos en varios exones o candidatos a límites para verificar el patrón.
El locus de referencia debe tener un número de copias estable en el objeto de estudio y amplificarse con una calidad similar a la de la diana. Debe incluir controles diploides, controles positivos y controles sin plantilla, además de verificar la varianza de las réplicas técnicas. También es importante validar la eficiencia y el rango dinámico mediante una curva estándar.
Pequeño ejemplo
Si en mediciones repetidas la cantidad relativa de un exón es aproximadamente la mitad que en un control normal y los exones adyacentes son normales, puede plantearse la hipótesis de una deleción heterocigota de ese exón. Sin embargo, una SNV en el sitio de unión del cebador puede impedir la amplificación de un alelo y producir el mismo patrón. Debe confirmarse con otro conjunto de cebadores o con un método independiente, como MLPA o secuenciación.
Aunque la señal sea aproximadamente doble, la qPCR por sí sola difícilmente determina si se trata de una duplicación en tándem, una copia insertada en otra posición o en qué alelo se encuentra.
MIQE e información que se debe registrar
Una qPCR reproducible requiere documentar el método de extracción, la calidad y cantidad del ADN, la secuencia de los cebadores o el ID del ensayo, el amplicón, la eficiencia, la configuración del umbral, las réplicas, los criterios de exclusión y el método de cálculo. Si solo se conserva el resultado, otro laboratorio difícilmente podrá reproducir la misma llamada del número de copias.
Incluya calibradores y controles en cada lote y examine la posición en la placa y el efecto del operador. No interprete en exceso una estimación decimal del número de copias como si fuera el número entero de copias en una célula real.
Puntos que pueden generar confusión
- ΔΔCq no es una fórmula válida automáticamente bajo cualquier condición.
- Una cantidad relativa de 0,5 o 1,5 no confirma por sí sola una deleción o duplicación.
- La qPCR de CNV genómica y la RT-qPCR de expresión de ARN no se sustituyen entre sí.
- Una concordancia elevada entre réplicas no excluye un sesgo sistemático de los cebadores.
Límites de la interpretación
La qPCR examina de forma dirigida el número de copias relativo de un locus, pero por sí sola no resuelve puntos de ruptura, reordenamientos complejos, pureza tumoral ni mosaicismo. Una llamada clínica requiere validación específica del ensayo y un método de confirmación independiente.
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La elección de prueba y sus puntos ciegos continúan en WGS, WES y panel; la anotación de variantes estructurales, en AnnotSV; y la fracción alélica y el mosaicismo, en VAF germinal y somática.