CRISPR/Cas9 — Después de la escisión, ocurre la reparación del ADN
Por qué es necesario saberlo
CRISPR/Cas9 permite localizar una posición de ADN deseada mediante un ARN guía y realizar una escisión mediante una nucleasa. Sin embargo, el momento en que Cas9 corta el objetivo es solo el inicio de la edición, no el resultado final. Dependiendo de cómo la célula repare el ADN tras la escisión, pueden producirse pequeñas indels, la sustitución deseada, grandes deleciones y reordenamientos complejos.
Por lo tanto, se debe distinguir entre cutting efficiency y proporción de células con el genotipo deseado. Si solo se observa un valor promedio, se pueden pasar por alto resultados que mezclan diferentes alelos y células.
Reconocimiento y escisión del objetivo
El espaciador del ARN guía se une de forma complementaria al ADN objetivo y la nucleasa Cas identifica un motivo adyacente corto llamado PAM. La actividad on-target y off-target varía según la posición y el número de desajustes (mismatches) y la accesibilidad de la cromatina. La puntuación de las herramientas de diseño de guías es una predicción para seleccionar candidatos y no sustituye la actividad real en la célula.
La Cas9 de tipo silvestre (wild-type) suele generar una rotura de doble cadena (double-strand break). Dado que las nickasas, las variantes de alta fidelidad y otras enzimas Cas alteran el método de escisión y el rango de PAM, no pueden tratarse con el mismo rendimiento bajo un único nombre como CRISPR.
La reparación genera el resultado
La reparación de tipo NHEJ es rápida, pero puede generar diversas inserciones y deleciones, por lo que se utiliza para el knockout que rompe el marco de lectura (coding frame). La HDR utiliza una plantilla de donante para insertar la secuencia deseada, pero es sensible al ciclo celular, a la entrega (delivery) y al tipo celular, y su eficiencia puede ser limitada. La distribución de los resultados varía según el objetivo, por lo que no se debe verificar únicamente un clon representativo.
También son posibles grandes deleciones, inversiones, translocaciones entre dos puntos de corte y cambios a escala cromosómica. La secuenciación de amplicones cortos puede no amplificar eventos grandes donde el sitio de unión del cebador ha desaparecido, haciendo que parezcan normales.
Edición de bases y edición de calidad (prime editing)
Los editores de bases convierten típicamente una base específica sin romper la doble cadena, mientras que los editores prime diseñan diversos cambios pequeños mediante una plantilla de retrotranscripción. Estos enfoques también presentan limitaciones como ediciones bystander, indels no deseados, efectos off-target en ARN y ADN, y restricciones en la entrega. No basta con confiar únicamente en los controles de calidad derivados del resultado de la nucleasa Cas9.
Para poder comparar los resultados, es necesario registrar conjuntamente el tipo de edición, la versión del editor, las secuencias guía y donante, el tipo celular y el método de entrega.
Ejemplo de experimento pequeño
Supongamos que se intentó corregir una SNV relacionada con una enfermedad y en la secuenciación masiva (bulk sequencing) se observó un alelo deseado del 40%. El 60% restante podría contener no solo el alelo original, sino también una mezcla de varios indels, y algunas células podrían haber editado los dos alelos de manera diferente. Es necesario verificar las combinaciones genotípicas mediante clonación a célula única o genotipado a célula única, junto con ensayos de largo alcance.
También se debe verificar si en el clon corregido se restauran la función proteica y el fenotipo, asegurando que no sea que solo hayan sobrevivido ciertos clones debido a una selección de crecimiento.
Seguridad y validación
La secuenciación dirigida únicamente de sitios off-target predichos no puede excluir los riesgos genómicos globales. Se deben combinar ensíos no sesgados (unbiased), análisis de cariotipo y a escala genómica, y la estabilidad en cultivos prolongados según el objetivo. La edición ex vivo permite extraer las células, examinarlas y luego administrarlas, pero conlleva riesgos de fabricación y expansión clonal; por otro lado, la edición in vivo tiene como aspectos centrales la entrega y la especificidad tisular.
Los tratamientos específicos aprobados han evaluado la guía, el proceso de fabricación, las células diana y la evidencia clínica de productos específicos. Esto no garantiza la seguridad de otras dianas o diseños de edición arbitrarios.
Puntos fáciles de confundir
- La proporción de lecturas on-target no es lo mismo que la proporción exacta de células correctamente editadas.
- Que los efectos off-target sean bajos no implica que no haya grandes variaciones estructurales on-target.
- El knockout no garantiza siempre una pérdida de función; pueden persistir transcritos alternativos.
- El éxito de la edición no equivale a la eficacia terapéutica.
Límites de la interpretación
Los resultados de CRISPR deben medir por separado la ubicación del objetivo, el resultado de la reparación, el mosaicismo celular, los efectos off-target y la recuperación funcional. Este texto explica principios de investigación y no orienta hacia la edición de personas o embriones arbitrarios ni hacia decisiones terapéuticas.
Lectura conectada
La evidencia de recuperación funcional continúa en Ensayos funcionales e interpretación de variantes; el contexto del efecto de la accesibilidad de la cromatina sobre la eficiencia de edición se vincula con el concepto ATAC-seq.