Germline y somático: no interpretar el VAF con reglas simples
¿Por qué es importante saberlo?
Tras identificar una variante en una prueba genómica, es necesario distinguir si dicha variante está presente en todo el organismo o si surgió en un tejido específico o en un tumor. Las variantes germinales pueden estar presentes en múltiples tejidos y células germinales desde el cigoto, con la posibilidad de transmitirse a la siguiente generación. Por otro lado, las variantes somáticas surgen en una línea celular específica después de la fecundación y se limitan a sus células descendientes.
Sin embargo, la biología real no se divide limpiamente en estas dos categorías. Las variantes que ocurren durante el desarrollo pueden crear mosaicismo, presente solo en algunos tejidos normales, y un clon adquirido en las células sanguíneas puede parecer germinativo en una prueba de sangre. Por lo tanto, no se debe asumir el origen basándose únicamente en el valor numérico de una sola muestra.
Conceptos clave
El VAF (fracción del alelo variante) es la proporción de lecturas de secuencia que apoyan el alelo variante en relación con el total de lecturas en esa posición. En una muestra diploide normal ideal, una variante germinal heterocigota podría estar cerca del 50%, y una variante homocigota cerca del 100%. Sin embargo, estos valores son expectativas, no umbrales de decisión. El valor real se ve afectado por la variación de muestreo, sesgos de alineamiento, el número de copias y la mezcla de muestras.
El VAF en muestras tumorales es más complejo; es el resultado combinado de la proporción de células tumorales, la proporción del clon que porta la variante, amplificaciones o deleciones en ese locus, la pérdida de heterocigosidad y la contaminación con células normales. Diferentes escenarios biológicos pueden producir el mismo VAF; un VAF alto no implica necesariamente una variante germinante, ni un VAF bajo indica necesariamente un error de secuenciación.
Ejemplo para pensar en números
Si una célula tumoral tiene una variante heterocigota y el número de copias es normal, pero solo la mitad de la muestra está compuesta por células tumorales, el VAF esperado sería aproximadamente del 25%. Sin embargo, este valor aumenta si hay amplificación del alelo variante o pérdida del alelo opuesto. Por el contrario, disminuye si la variante está presente solo en un subclon específico.
Incluso si se observa un VAF de aproximadamente el 10% en sangre normal, es necesario distinguir entre mosaicismo de bajo nivel, hematopoyesis clonal, contaminación y errores técnicos. Los números ayudan a reducir las hipótesis, pero no demuestran por sí mismos el origen.
El papel del normal emparejado
Analizar conjuntamente muestras tumorales y normales permite comparar variantes comunes a ambas con variantes enriquecidas en el tumor. Sin embargo, una muestra de sangre no siempre es un control normal perfecto. Si se sospecha una neoplasia hematológica, mosaicismo hematopoyético o hematopoyesis clonal, puede ser necesario utilizar otro tejido, como fibroblastos cutáneos.
El estudio familiar ayuda a evaluar la heredabilidad y la segregación, pero no excluye todo el mosaicismo tisular del paciente. Elegir una muestra adecuada para el objetivo de la prueba es tan importante como el algoritmo de análisis.
Profundidad y límite de detección
La profundidad de lectura aumenta las oportunidades de observación, pero no representa todo el rendimiento del ensayo. Para detectar una fracción alélica baja deben validarse conjuntamente la preparación de la biblioteca, el número de moléculas únicas, la calidad de bases y de mapeo, el equilibrio entre hebras y el patrón de errores por posición. Miles de lecturas que incluyen duplicados de PCR pueden no corresponder a miles de moléculas independientes.
El laboratorio establece el límite de detección, la sensibilidad, la especificidad y la reproducibilidad para cada tipo de variante y fracción alélica. El rendimiento para SNV no puede aplicarse directamente a indels, CNV o variantes estructurales.
Puntos que pueden generar confusión
- La VAF y la proporción de células no son el mismo valor.
Germinalno significa patogénico ysomáticotampoco significa driver del cáncer.- En una prueba solo tumoral debe distinguirse un posible hallazgo germinal de un resultado germinal confirmado.
- Una profundidad elevada no corrige automáticamente el mapeo incorrecto en regiones homólogas ni los errores sistemáticos.
Limitaciones
Interpretar la VAF requiere conocer el tipo y el momento de obtención de la muestra, el método de estimación de pureza tumoral, el número de copias local, el historial terapéutico y la versión del pipeline. Sin esta información, incluso un decimal preciso sigue siendo una medición incierta. Confirmar el origen clínico puede requerir tejido normal independiente y un ensayo germinal validado.
Para leer más
Se relaciona con Heterocigosis compuesta y fase, que trata la disposición alélica de dos variantes, y con Elección entre WGS, WES y panel, que compara el alcance y los puntos ciegos de las pruebas.