ATAC-seq — El alcance de la expresión "observar directamente la cromatina abierta"
Por qué es importante conocerlo
Las células con la misma secuencia de ADN pueden utilizar diferentes genes dependiendo de qué regiones reguladoras mantengan abiertas. ATAC-seq estima la accesibilidad de la cromatina a escala genómica con relativamente pocas células, permitiendo identificar el estado celular y candidatos a elementos reguladores. Sin embargo, la expresión "observar directamente la cromatina abierta" puede simplificar excesivamente el principio de medición.
La señal de ATAC-seq es un conjunto de eventos en los que la transposasa pudo acceder al ADN e insertar adaptadores. Aunque está relacionada con la accesibilidad, también se ve influenciada por la localización nuclear, la estructura de la cromatina, los sesgos de secuencia y las condiciones experimentales.
Tn5 y tagmentation
La transposasa Tn5, con adaptadores unidos previamente, corta el ADN accesible mientras inserta los adaptadores. Los fragmentos generados se amplifican por PCR y se secuencian, alineándose posteriormente contra el genoma de referencia. El punto de inicio de las lecturas puede corregirse mediante un desplazamiento (offset) para reflejar la posición de inserción de Tn5.
Los fragmentos cortos pueden corresponder a regiones libres de nucleosomas, mientras que la periodicidad de los fragmentos más largos podría estar relacionada con la protección de mono- y di-nucleosomas. Este patrón indica la calidad de la biblioteca, pero no se debe esperar que tenga la misma forma o puntos de corte en todos los tipos celulares.
Lo que significan los picos (peaks)
El llamador de picos (peak caller) identifica regiones donde las inserciones están concentradas en comparación con el fondo. Un pico puede ser un candidato a promotor, potenciador u otra región accesible. El hecho de que exista un pico no permite concluir que un factor de transcripción específico se haya unido o que un gen cercano esté expresado.
El enriquecimiento de motivos y el footprinting pueden sugerir factores posibles, pero están sujetos a la influencia de proteínas que comparten motivos, al sesgo de Tn5 y a la profundidad de secuenciación. La unión de TFs debe confirmarse con evidencias independientes, como series de ChIP o perturbaciones.
Lectura del control de calidad
El enriquecimiento en TSS verifica si la señal alrededor de los sitios de inicio de transcripción anotados es más marcada que el fondo; FRiP observa la proporción de lecturas mapeadas totales que caen dentro de los picos. También se evalúan conjuntamente la complejidad de la biblioteca, duplicados, la proporción de lecturas mitocondriales, la periodicidad del tamaño de fragmento y la concordancia entre réplicas. Que un indicador sea bueno no significa que toda la biblioteca apruebe el control de calidad.
La apoptosis, la lisis excesiva y la preparación de núcleos pueden aumentar el fondo. Dado que los rangos normales varían según el tejido y el protocolo, es preferible observar la distribución y la reproducibilidad dentro del mismo diseño experimental en lugar de depender de un punto de corte único universal.
Pequeño ejemplo comparativo
Supongamos que el pico de ATAC de un candidato a potenciador aumenta en las células inmunitarias tras la estimulación. Esto constituye evidencia de que la accesibilidad en esa región ha aumentado después de la estimulación. Si las marcas de histona en la misma región, la expresión génica cercana y la unión de factores de transcripción (TF) cambian en la misma dirección, la hipótesis de regulación se fortalece. Para avanzar hacia una causalidad funcional, es necesario verificar si la eliminación del potenciador o la edición del motivo alteran la expresión y el fenotipo celular.
En ATAC-seq a granel, resulta difícil distinguir entre un aumento en la accesibilidad intracelular específica y un cambio en la proporción de tipos celulares específicos.
ATAC-seq de célula única
El ATAC-seq de célula única separa los fragmentos accesibles por célula para inferir el tipo y el estado celular. Dado que el número de fragmentos observados en una sola célula es bajo, la matriz es muy dispersa; por ello, a menudo se utilizan pseudo-bulk (agregando múltiples células) y modelos de temas. Se debe verificar que los dobletes, los núcleos de baja calidad y los lotes no formen clusters artificiales.
Aunque puede medirse junto con ARN o integrarse computacionalmente, la conexión entre dos modalidades depende del modelo. La ecuación de que la accesibilidad equivale a la expresión no es válida.
Puntos fáciles de confundir
- La cromatina abierta no siempre significa un potenciador activo.
- La altura del pico se ve influenciada por el número de células, la profundidad y la normalización.
- La presencia de un motivo no es evidencia de unión de TF.
- Las diferencias a granel pueden deberse a cambios en la composición celular.
- Las etiquetas de cluster de célula única requieren marcadores independientes y validación biológica.
Límites de la interpretación
El ATAC-seq es una medición sustituta de la accesibilidad y no prueba por sí solo la expresión génica, la unión de TF ni la causalidad en enfermedades. La preparación de la muestra, el control de calidad (QC), las réplicas y el contexto celular relevante forman parte del resultado.
Lectura conectada
El proceso que vincula una variante accesible con su gen diana continúa en GWAS no codificante y contacto de cromatina; la asociación con la expresión, en eQTL; y la validación mediante perturbación, en el concepto CRISPR/Cas9.