GWAS de regiones no codificantes — Desde señales asociadas hasta mecanismos reguladores
¿Por qué es importante conocerlo?
Muchas señales de asociación de enfermedades detectadas en estudios GWAS se encuentran fuera de los exones que codifican proteínas. Para comprender estas señales, no basta con detenerse en la pregunta de "¿qué gen está más cerca del SNP más significativo"; es necesario reducir progresivamente las posibilidades hasta identificar el candidato a variante causal real, así como las células, elementos reguladores y genes diana afectados.
El hecho de que una región sea no codificante no significa que carezca de función. Puede contener potenciadores (enhancers), promotores, aislantes y diversos elementos reguladores de ARN. Sin embargo, como una sola anotación no demuestra la función, es necesario combinar de manera escalonada evidencias estadísticas, de cromatina, de expresión y de perturbación.
Conceptos clave
La variante líder (lead variant) de un GWAS es un marcador que representa la señal de asociación en un locus determinado. Cuando las variantes circundantes se heredan juntas debido al desequilibrio de ligamiento (linkage disequilibrium), el hecho de que una variante tenga el valor p más pequeño no garantiza que sea la variante funcional real. Es necesario realizar un mapeo fino (fine-mapping) teniendo en cuenta las diferencias de LD entre ancestrías, la calidad de la imputación y múltiples señales independientes, para generar un conjunto creíble (credible set) con alta probabilidad de contener la variante causal.
El conjunto creíble no es una lista de respuestas correctas, sino un conjunto probabilístico de candidatos que depende del modelo utilizado y de la referencia de LD utilizada. Si la muestra es pequeña o el LD es fuerte, habrá más candidatos; además, si las suposiciones sobre el número de variantes causales son incorrectas, el conjunto puede distorsionarse. Los datos de otras ancestrías y cohortes independientes pueden ayudar a reducir aún más los candidatos.
Pasos para integrar el contexto regulador
Se debe verificar si la variante candidata se superpone con una cromatina abierta o marcas de potenciadores en el tejido relevante. Los cambios en los motivos de unión y la accesibilidad específica del alelo sugieren posibles mecanismos de regulación transcripcional. Sin embargo, la superposición no prueba que esa posición tenga una función real en el estado de enfermedad; es necesario que coincidan el tipo celular y las condiciones de estimulación.
Los estudios eQTL y la colocalización evalúan la posibilidad de que un mismo locus comparta señales tanto para la expresión génica como para el rasgo de la enfermedad. El gen diana podría estar más lejos en lugar de ser el más cercano, y un solo potenciador podría conectarse con múltiples genes.
Lo que miden las técnicas de la serie 3C
3C corta y liga la cromatina fija para luego medir la frecuencia de contacto entre dos loci seleccionados. 4C examina los socios en todo el genoma desde un punto de vista, mientras que Hi-C examina la matriz de contacto en todo el genoma. Existen variantes que enriquecen regiones específicas, como capture-C y promoter capture Hi-C.
Este valor es una medida indirecta de la frecuencia con la que dos segmentos de ADN estuvieron cerca en una población celular. Está sujeto a la influencia de la distancia genómica, el sitio de restricción, el contenido de GC, la mapeabilidad, la profundidad de secuenciación y la normalización. Los bucles (loops) de bulk Hi-C pueden no ser estructuras fijas que existan siempre en todas las células.
Un pequeño ejemplo
Supongamos que en el conjunto creíble (credible set) de un locus de enfermedad hay una variante dentro de un potenciador (enhancer), que en las células inmunitarias relacionadas el alelo de riesgo altera la accesibilidad, y que ese potenciador entra en contacto con el promotor del gen B situado a 200 kb de distancia. Si esto colocaliza con la misma señal hasta el eQTL del gen B, se obtiene una hipótesis coherente.
Aun así, el contacto por sí solo no es una condición suficiente para la regulación. La cadena causal se fortalece cuando, al realizar una perturbación precisa de la variante o del potenciador, la expresión del gen B y el fenotipo celular relacionado con la enfermedad cambian en la dirección esperada, y esto se reproduce en experimentos independientes.
Escalera de evidencia
A medida que se avanza por asociación GWAS → candidato con fine-mapping → anotación de cromatina en la célula relevante → efecto molecular específico del alelo → conexión con contacto/eQTL → perturbación → fenotipo, las afirmaciones sobre el mecanismo se vuelven más específicas. No todas las investigaciones necesitan llegar a la etapa final, pero debe indicarse claramente hasta qué etapa se ha verificado.
Puntos que pueden causar confusión
- El SNP líder (lead SNP) no es sinónimo de la variante causal.
- El solapamiento de potenciadores (enhancer overlap) no especifica el gen objetivo.
- El contacto de la cromatina no es equivalente a la regulación activa.
- El solapamiento entre eQTL y GWAS no demuestra automáticamente una señal causal compartida.
- El efecto de un ensayo reportero puede diferir del efecto en el contexto cromatínico original.
Limitaciones
Si resulta difícil obtener directamente el tejido relevante para la enfermedad y se utilizan células sustitutas, el contexto puede cambiar. El fine-mapping y los mapas de contacto dependen de la ancestría, el estado celular y la resolución analítica. Los resultados deben registrar el ensamblaje genómico, la referencia de LD, el tipo celular, el ensayo y la versión del pipeline utilizados.
Lectura relacionada
Las asociaciones de expresión y la colocalización continúan en eQTL; la medición de cromatina abierta, en ATAC-seq; y las coordenadas de referencia y la representación de alelos, en el concepto Genoma de referencia.