Para cerrar un genoma fragmentado en un solo círculo

Aunque ensamblamos E. coli con SPAdes en S22, el resultado no fue un único cromosoma circular completo, sino decenas o cientos de contigs. La causa es clara: las lecturas cortas (150 pb) no pueden saltar repeticiones más largas que ellas mismas. Ante una repetición de 5 kb que aparece múltiples veces en el genoma, como los operones de rRNA, el gráfico se bifurca y las lecturas carecen de información para determinar cuál camino es el correcto.

La clave está en las lecturas largas. Nanopore o PacBio leen varios kb hasta decenas de kb de una vez, cruzando las repeticiones por completo. Sin embargo, tienen una tasa de error más alta (especialmente Nanopore de flujo circular). Aquí surge la idea: usar la precisión de las lecturas cortas para construir la secuencia y la longitud de las lecturas largas para unir los fragmentos. Esta fusión es el ensamblaje híbrido, y su herramienta estándar en genomas bacterianos es Unicycler.

Cómo fusiona Unicycler ambas señales

El flujo de trabajo de Unicycler tiene una estructura intuitiva de tres actos.

1. Crear un gráfico preciso con lecturas cortas. Ejecuta internamente SPAdes con múltiples valores de k para seleccionar el mejor gráfico de De Bruijn (grafo de ensamblaje). Las secuencias de este gráfico son precisas, pero permanecen bifurcadas en los puntos repetitivos.
2. Tender puentes con lecturas largas. Alinea las lecturas largas a este gráfico (mediante minimap2 o similar) para verificar si una lectura que cruza la repetición conecta realmente "el final del camino A → la repetición → el inicio del camino B". Si múltiples lecturas largas respaldan el mismo puente, se confirma ese camino.
3. Plegar el gráfico de forma voraz. Aplica los puentes confirmados uno por uno según su confianza, simplificando el gráfico. Si tiene éxito, el cromosoma se cierra en un único círculo cerrado, y los plásmidos se organizan en sus propios círculos pequeños.

La idea central es que las lecturas largas no se usan como fuente de secuencia. Las lecturas largas solo proporcionan información de conexión sobre "qué camino conduce a cuál", mientras que las lecturas cortas, gracias a su precisión, son responsables de la secuencia final de nucleótidos. Este diseño aprovecha las fortalezas de ambos datos y compensa mutuamente sus debilidades.

¿Por qué es importante el círculo cerrado?

El cromosoma bacteriano es realmente circular. Que el ensamblaje se cierre en un solo círculo es una evidencia sólida de que "se ha reconstruido el genoma completo sin omisiones ni superposiciones". Esto se denomina genoma completo/cerrado, y tiene un nivel de confianza distinto al de los genomas borradores fragmentados.

En particular, los plásmidos son de gran importancia clínica, ya que los genes de resistencia a los antibióticos se encuentran en los plásmidos y se transmiten entre las cepas. Con las lecturas cortas, las secuencias de los plásmidos tienden a mezclarse con los fragmentos cromosómicos, lo que dificulta su identificación; sin embargo, Unicycler separa cada replicón en un círculo independiente, lo que permite responder a la pregunta: "¿Este gen de resistencia se encuentra en el cromosoma o en un plásmido móvil?".

Ensamblaje del genoma completo con Galaxy y la línea de comandos

Se puede realizar de la misma manera, ya sea haciendo clic en usegalaxy.eu o mediante la línea de comandos.

Flujo de trabajo de Galaxy

1. Cargar — 2 lecturas cortas emparejadas y 1 lectura larga (Nanopore/PacBio).
2. Control de calidad — Verificar la distribución de longitud y calidad con FastQC/fastp para las lecturas cortas y con NanoPlot para las lecturas largas.
3. Unicycler — Especificar short_1/short_2 + long. --mode = normal (predeterminado) / bold / conservative.
4. Bandage — Abrir assembly.gfa y verificar visualmente que cada replicón esté cerrado en forma de círculo.

Línea de comandos

unicycler \
  -1 short_R1.fastq.gz \
  -2 short_R2.fastq.gz \
  -l long_reads.fastq.gz \
  -o hybrid_out \
  --mode normal \
  -t 8

# Verificación del gráfico de resultados
Bandage image hybrid_out/assembly.gfa assembly.png

--mode conservative aplica solo los puentes con un sólido respaldo para minimizar la sobreasamblea (lo que puede dejar más fragmentos), mientras que bold cierra los círculos de manera más agresiva (aumentando el riesgo). Para informes clínicos, es más seguro comenzar con un enfoque conservador y revisar la evidencia.

La secuencia marcada con circular=true en el encabezado assembly.fasta del resultado es el replicón completo. Si Bandage muestra un círculo continuo (cromosoma) y varios círculos pequeños (plásmidos), el proceso habrá sido exitoso.

Correspondencia de conceptos

• Unión de grafos mediante puentes: Fusionar nodos mediante puentes confirmados es una reducción del grafo, y la simplificación del grafo S22 se extiende con la evidencia de lecturas largas.
• Fusión de sensores: Combinar lecturas cortas, precisas pero de corto alcance, con lecturas largas, imprecisas pero de largo alcance, es un concepto similar a la fusión de sensores en robótica o procesamiento de señales.
• Algoritmo voraz: Aplicar los puentes por orden de confianza es una estrategia voraz típica. Tiene similitudes estructurales con la construcción del árbol de expansión mínima de Kruskal.
• Alineamiento de lecturas largas: El alineamiento utilizado para validar los puentes está directamente relacionado con minimap2 (basado en minimizadores) de M16.

Problemas comunes

• Cobertura insuficiente de lecturas largas: Si hay pocas lecturas largas que respalden los puentes, el círculo no se cerrará. Para bacterias, generalmente se recomienda una cobertura de 40 a 100× con lecturas largas.
• Confundir datos Nanopore antiguos y de baja calidad como fuente de secuencia: Unicycler solo utiliza lecturas largas para conectar; la precisión final de la secuencia depende de la calidad de las lecturas cortas.
• Uso excesivo de --mode bold: Intentar forzar el cierre del círculo puede generar sobreasamblea. Un círculo sin fundamento es peor que un borrador.
• Uso en genomas eucariotas grandes: Unicycler está diseñado exclusivamente para bacterias, plásmidos y genomas pequeños. Para genomas grandes, como los de humanos o plantas, herramientas como hifiasm (M24) son más adecuadas.

Para profundizar

El texto es una descripción reconstruida directamente por BPD. Para un aprendizaje más avanzado, utilice los siguientes recursos de referencia.

• Galaxy Training Network: Tutorial Unicycler Assembly (training.galaxyproject.org, documentación completa). Es el estándar para prácticas híbridas de lecturas cortas y largas.
• Artículo original: Wick, Judd, Gorrie, Holt (2017), Unicycler: Resolving bacterial genome assemblies from short and long sequencing reads, PLoS Computational Biology 13:e1005595. Es la fuente del algoritmo de unión de grafos.
• Calidad de las lecturas largas: NanoPlot / NanoComp (github.com/wdecoster/NanoPlot) — herramienta para verificar la distribución de la longitud y la calidad de las lecturas largas.
• Flujo de trabajo para el ensamblaje completo del genoma: Trycycler de Wick & Holt Trycycler (github.com/rrwick/Trycycler) — herramienta que integra múltiples ensamblajes de lecturas largas para obtener un consenso, mejorando aún más la calidad del ensamblaje.

Ahora hemos completado el ensamblaje de un genoma. Sin embargo, las muestras clínicas o ambientales suelen contener cientos de especies mezcladas. En el siguiente capítulo S24, pasaremos a la metagenómica (Kraken2 y MetaPhlAn) para clasificar esta mezcla por especie.