¿Por qué los llamadores de SNP pasan por alto las SV?

HaplotypeCaller detecta indels de aproximadamente 40 pb o menos. Para variantes de mayor tamaño (desde 50 pb hasta varios Mpb) se requieren herramientas específicas. Estas grandes variantes se denominan variantes estructurales (Structural Variant, SV).

Los cinco tipos de SV.

• DEL (Deleción): Un segmento presente en la referencia desaparece en el individuo.
• DUP (Duplicación): Un segmento de la referencia se repite en el individuo.
• INV (Inversión): El segmento queda invertido.
• TRA (Translocación): Rearreglo entre diferentes cromosomas.
• INS (Inserción): Se inserta una secuencia que no está presente en la referencia.

En estudios de genómica del cáncer, enfermedades genéticas y evolución, las SV suelen ser señales determinantes. Sin embargo, el ensamblaje local de HaplotypeCaller utiliza una ventana de cientos de pb, por lo que no puede capturar grandes SV completas. De ahí la necesidad de herramientas específicas para SV.

Tres firmas — ¿Cómo se detectan las SV?

Los tres tipos de evidencia utilizados por las herramientas de detección de SV.

1. Pares de lecturas discordantes

La distancia entre R1 y R2 en las lecturas emparejadas (paired-end) está determinada por el tamaño del inserto de la librería (por ejemplo, 300–500 pb). Si esta distancia se desvía significativamente, es una señal de que hay una SV en medio.

• Si el inserto esperado es de 400 pb pero la distancia entre R1 y R2 es de 3000 pb → posible DEL de 2600 pb en medio.
• Si R1 se alinea en el cromosoma 1 y R2 en el cromosoma 7 → posible TRA entre dos cromosomas.

2. Lecturas divididas (Split Read)

Cuando una lectura cruza el límite de una SV, se produce un alineamiento dividido (split alignment), donde la primera parte se alinea en la posición A y la segunda en la posición B (alineamiento suplementario de BWA).

• Los primeros 80 pb de la lectura se alinean en chr7:100 y los últimos 70 pb en chr7:3000 → hay un DEL en medio.
• La primera parte se alinea en el cromosoma 1 y la segunda en el cromosoma 7 → punto de ruptura entre dos cromosomas.

3. Profundidad de lectura (Read Depth)

Una gran DEL hace que la cobertura de ese segmento caiga a la mitad (heterocigoto) o a cero (homocigoto). Una gran DUP hace que la cobertura aumente a 1,5× o 2×.

• En un WGS esperado de 30×, si un segmento específico de 100 kbp tiene 15× → candidato a DEL heterocigoto.
• Si un segmento específico de 50 kbp tiene 60× → candidato a DUP heterocigoto.

Las herramientas de detección de SV utilizan estas tres firmas en diversas combinaciones.

Manta — Ensamblaje de grafos + paired-end

Herramienta desarrollada por Illumina. Es el estándar de facto para la detección de SV en la era de las lecturas cortas.

Principio

1. Escanea pares discordantes y lecturas divididas.
2. Agrupa estas evidencias para generar un grafo de puntos de ruptura candidatos a SV.
3. En cada punto candidato, ensamblaje local → confirmación precisa de la secuencia del punto de ruptura.
4. Asignación de puntuaciones de confianza.

Comando de ejecución

configManta.py \
    --normalBam normal.bam \
    --tumorBam tumor.bam \
    --referenceFasta hg38.fa \
    --runDir manta_run

manta_run/runWorkflow.py -m local -j 16

Estilo de Configure + runWorkflow como Strelka2.

Fortalezas

• Detección SV a corto plazo y omnidireccional: Soporta DEL, DUP, INV y TRA.
• Velocidad: La mayoría de las muestras WGS se procesan en unas pocas horas.
  • Pipeline estándar: Incluido en la mayoría de los pipelines como nf-core/sarek.

Debilidades

• DUP grandes · CNV: El uso de firmas de profundidad de lectura es limitado. Se requiere el uso combinado con herramientas adicionales como CNVkit.
• No soporta lecturas largas: Para PacBio HiFi se utilizan Sniffles y pbsv.

Delly — Especializado en firmas de pares emparejados

Herramienta desarrollada por Tobias Rausch en EMBL. Similar a Manta pero con optimización específica para cada tipo de SV.

Principio

• Definir previamente las firmas de pares emparejados por tipo de SV.
• Escanear los clústeres de pares de lecturas adecuados para cada firma.
• Determinar la secuencia del punto de ruptura mediante lecturas divididas en cada clúster.

Comando de ejecución

# Ejecutar por separado para cada tipo de SV
delly call -t DEL -o S1.del.bcf -g hg38.fa S1.bam
delly call -t DUP -o S1.dup.bcf -g hg38.fa S1.bam
delly call -t INV -o S1.inv.bcf -g hg38.fa S1.bam
delly call -t TRA -o S1.tra.bcf -g hg38.fa S1.bam

# Integrar
bcftools concat S1.del.bcf S1.dup.bcf S1.inv.bcf S1.tra.bcf -Ob -o S1.sv.bcf

Fortalezas

• Ajuste por tipo de SV: Especializado en las características específicas de cada firma.
• Fuerte soporte para somáticos: Se adapta bien a la llamada de SV en pares tumor-normal.
• Robusto ante SV pequeños (50～500pb).

Debilidades

• Limitaciones en el manejo de variantes complejas: Sensibilidad reducida en regiones complejas donde se superponen múltiples SV.

GRIDSS — Enfoque basado en ensamblaje

Herramienta publicada por el laboratorio de Papenfuss en 2017. Utiliza un enfoque basado en ensamblaje para localizar con precisión la secuencia del punto de ruptura.

Principio

1. Ensamblaje local a partir de lecturas en la región de interés.
2. Confirmación del punto de ruptura donde la secuencia ensamblada se une de manera diferente a la referencia.
3. Validación mediante evidencia discordante/dividida en ese punto.

Es decir, primero se realiza el ensamblaje y luego se valida mediante la firma de las lecturas.

Comando de ejecución

gridss \
    --reference hg38.fa \
    --output S1.sv.vcf.gz \
    --assembly S1.assembly.bam \
    --workingdir gridss_work \
    -t 16 \
    S1.bam

Fortalezas

• Punto de ruptura más preciso: Basado en ensamblaje, ofrece precisión a nivel de nucleótido.
• Manejo de variantes complejas: Desentraña bien regiones con múltiples SV entrelazados.
• SV en genomas de cáncer: Excelente para detectar genes de fusión y reordenamientos complejos.

Debilidades

• Alto costo computacional: 2 a 5 veces más lento que Manta/Delly.
• Complejidad del filtrado de resultados: El VCF original es crudo, por lo que es indispensable un pipeline posterior de filtrado.

Matriz práctica de las tres herramientas

Campos especiales del VCF de SV

El VCF de SV difiere del VCF de SNP porque debe expresar dos coordenadas (inicio y fin).

• SVTYPE=DEL: Tipo de SV.
• END=100500: Coordenada final.
• SVLEN=-500: Longitud del SV (negativo para DEL).
• CIPOS=-10,10: Incertidumbre de la posición del breakpoint.
• IMPRECISE: Breakpoint preciso no determinado.

Se pueden visualizar los SV en IGV utilizando estos campos.

Cálculo manual — Detección de DEL con lecturas discordantes

La inserción de la biblioteca es de 400pb ± 50pb (media 400, DE 50). La distancia esperada entre R1 y R2 en condiciones normales es aproximadamente de 300 a 500pb.

En una posición específica, se agrupan 10 lecturas con una distancia R1-R2 de 2500pb.

• 2500 - 400 = 2100pb exceden lo esperado → hay un candidato a DEL de aproximadamente 2100pb entre ellas.
• Si 10 lecturas muestran la misma firma, la probabilidad de que sea casual es extremadamente baja.
• Llamada de DEL confirmada.

Las herramientas de SV realizan automáticamente este agrupamiento.

Benchmarking de SV — dbVar y GIAB SV

Estándar para el benchmarking de SV.

• Conjunto de verdad GIAB HG002 SV: Conjunto de referencia de SV humano. Formato VCF.
• Truvari: Herramienta de comparación de VCF de SV (versión de hap.py para SV).

truvari bench -b truth.sv.vcf.gz -c manta.sv.vcf.gz -o truvari_out --pctsim 0.5

Los resultados muestran Precision, Recall y F1 de manera similar al benchmark de SNP.

Práctica pequeña en Colab

Dado que el genoma humano completo es pesado para Manta, se puede realizar una demostración enfocándose únicamente en el cromosoma 22.

!apt-get install -y python2 wget >/dev/null
!wget -q https://github.com/Illumina/manta/releases/download/v1.6.0/manta-1.6.0.centos6_x86_64.tar.bz2
!tar xjf manta-1.6.0.centos6_x86_64.tar.bz2

!./manta-1.6.0.centos6_x86_64/bin/configManta.py \
    --bam chr22_sample.bam \
    --referenceFasta hg38_chr22.fa \
    --runDir manta_out

!manta_out/runWorkflow.py -m local -j 2

En el VCF resultante pueden verse las SV detectadas en el cromosoma 22: principalmente indels pequeños y algunas SV.

Mapeo de CS

• Ensamblaje de grafos: en el grafo de puntos de ruptura de Manta, los nodos representan posiciones y las aristas, pares de lecturas.
• Assembly-first frente a signature-first: GRIDSS prioriza el ensamblaje; Manta y Delly priorizan las firmas.
• Integración de múltiples evidencias: consulte el episodio de DryBench «Detección basada en grafos» (graph-based-detection).

Conclusión

Las SV son señales del genoma humano que no deben pasarse por alto, especialmente en genómica del cáncer y trastornos del desarrollo. Comprender la relación entre Manta, Delly y GRIDSS facilita incorporarse a un proyecto. En el siguiente episodio (S15) veremos cómo analizar con herramientas específicas las CNV, un subtipo especial de SV relacionado con alteraciones del número de copias.

Para profundizar

• Chen X. et al. (2016), Manta: rapid detection of structural variants and indels for germline and cancer sequencing applications. Bioinformatics 32:1220. Artículo original de Manta.
• Rausch T. et al. (2012), DELLY: structural variant discovery by integrated paired-end and split-read analysis. Bioinformatics 28:i333. Artículo original de Delly.
• Cameron D.L. et al. (2017), GRIDSS: sensitive and specific genomic rearrangement detection using positional de Bruijn graph assembly. Genome Research 27:2050. Artículo original de GRIDSS.
• Zook J.M. et al. (2020), A robust benchmark for detection of germline large deletions and insertions. Nature Biotechnology 38:1347. Benchmark de SV de GIAB.
• SV-plaudit (https://github.com/jbelyeu/SV-plaudit): herramienta de visualización de SV en IGV.

Ejecutar Manta una vez y visualizar el resultado en IGV ayuda a desarrollar intuición sobre las SV. En el siguiente episodio pasaremos a las CNV.