Aquí es donde se separan la línea germinal y la somática

En el capítulo anterior, HaplotypeCaller llamó los genotipos individuales. La llamada se basa en el supuesto de que cada individuo tiene un solo genotipo (0/0, 0/1, 1/1).

El tejido tumoral viola este supuesto. Dentro del tumor hay mezclas de varios subclones celulares, y algunas variantes están presentes solo en el 5% de las células tumorales. El propio concepto de genotipo deja de ser válido.

• Línea germinal: Variantes heredadas que se originan en las células normales. Frecuencia alélica (VAF) de 0,5 o 1,0.
• Somática: Variantes somáticas presentes solo en un grupo celular específico. VAF con cualquier valor (0,01 a 0,5).

Para reflejar esta diferencia estadística, GATK4 ha preparado por separado la herramienta Mutect2.

Idea central — Prueba de razón de verosimilitud

La forma del juicio de Mutect2 es la siguiente.

Se comparan dos hipótesis para el conjunto de lecturas observadas en una posición específica:

• H0 (hipótesis nula): Las lecturas observadas en esta posición pueden explicarse únicamente por errores de secuenciación y fondo normal.
• H1 (alternativa): Existe aquí una verdadera variante somática. La VAF es una estimación basada en los datos.

Se calcula la razón de verosimilitud entre las dos hipótesis y, si supera un umbral crítico, se acepta H1 (hay variante).

Si este valor LOD (Log Odds) es mayor o igual a 6,3, se realiza la llamada de variante. Cuanto más bajo sea este umbral, mayor será la sensibilidad y aumentarán los falsos positivos. El umbral predeterminado de Mutect2 representa un punto de equilibrio entre sensibilidad y especificidad.

Tres escenarios

Mutect2 puede ejecutarse de tres maneras diferentes.

1. Par tumor-normal

Cuando se han secuenciado tanto el tejido normal (por ejemplo, sangre) como el tejido tumoral del mismo paciente. Es lo ideal.

gatk Mutect2 \
    -R hg38.fa \
    -I tumor.bam -tumor SAMPLE01_T \
    -I normal.bam -normal SAMPLE01_N \
    --germline-resource af-only-gnomad.hg38.vcf.gz \
    --panel-of-normals pon.vcf.gz \
    -O SAMPLE01.somatic.vcf.gz

• Si se encuentra en tejido normal → germline → filtrar.
• Si solo está presente en el tumor → somático → marcar como variante.
• Recurso de variantes germinales: frecuencia alélica poblacional. Las variantes comunes tienen mayor probabilidad de ser germinales.

2. Solo tumor (Tumor-Only)

Cuando no hay un control normal disponible (datos heredados, diagnóstico urgente). La PoN actúa como sustituto del control normal.

gatk Mutect2 \
    -R hg38.fa \
    -I tumor.bam \
    --germline-resource af-only-gnomad.hg38.vcf.gz \
    --panel-of-normals pon.vcf.gz \
    -O SAMPLE01.tumor_only.vcf.gz

Aunque la precisión es ligeramente menor que en los pares tumor-normal, si el PoN es fiel, alcanza un nivel práctico.

3. Modo mitocondrial

Las mitocondrias tienen cientos de copias por célula y existe heteroplasmia (coexistencia de múltiples genotipos mitocondriales dentro de la misma célula), lo que requiere un tratamiento especial:

gatk Mutect2 --mitochondria-mode -R hg38.fa -I sample.bam -O mt.vcf.gz

Panel of Normals (PoN) — Mapa de artefactos de secuenciación

El PoN es un archivo con la siguiente estructura:

• Llamada de variantes en modo tumor-only con Mutect2 para cada una de varias muestras normales (se recomiendan 40+ individuos).
• Integración de los resultados para seleccionar las posiciones que aparecen repetidamente en múltiples muestras normales y guardarlas en un archivo VCF.

Estas posiciones constituyen el mapa de artefactos de secuenciación (ruido de la plataforma, errores de mapeo en regiones repetitivas). Cuando Mutect2 realiza la llamada de variantes en un nuevo tumor, las llamadas en estas posiciones se excluyen automáticamente.

Creación del PoN

# 1) Llamar cada muestra normal con Mutect2 en modo tumor-only
for normal_bam in normal_samples/*.bam; do
    S=$(basename "$normal_bam" .bam)
    gatk Mutect2 -R hg38.fa -I "$normal_bam" \
        --max-mnp-distance 0 \
        -O pon_vcfs/${S}.vcf.gz
done

# 2) Integrar con GenomicsDB
gatk GenomicsDBImport -R hg38.fa -L intervals.bed \
    --genomicsdb-workspace-path pon_db \
    -V pon_vcfs/N1.vcf.gz -V pon_vcfs/N2.vcf.gz ...

# 3) CreateSomaticPanelOfNormals
gatk CreateSomaticPanelOfNormals -R hg38.fa \
    -V gendb://pon_db \
    --germline-resource af-only-gnomad.hg38.vcf.gz \
    -O pon.vcf.gz

Estos tres pasos permiten crear un PoN (Panel of Normals) específico para el equipo. Aunque se puede utilizar directamente el PoN estándar publicado por Broad Institute (basado en 40 muestras de 1000G), la precisión podría disminuir si difiere del equipo y las bibliotecas propias, por lo que es ideal contar con un PoN propio del equipo.

FilterMutectCalls — Filtrado posterior

El VCF llamado por Mutect2 es crudo y debe aplicarse un filtrado posterior para obtener el conjunto final.

# 1) Estimar la contaminación
gatk GetPileupSummaries \
    -I tumor.bam \
    -V small_exac_common.vcf.gz \
    -L small_exac_common.vcf.gz \
    -O tumor_pileups.table

gatk CalculateContamination \
    -I tumor_pileups.table \
    -O tumor_contamination.table

# 2) FilterMutectCalls
gatk FilterMutectCalls \
    -R hg38.fa \
    -V SAMPLE01.somatic.vcf.gz \
    --contamination-table tumor_contamination.table \
    -O SAMPLE01.filtered.vcf.gz

FilterMutectCalls aplica más de diez filtros. Los filtros que se encuentran con mayor frecuencia son los siguientes:

• germline: Se determina que hay una alta probabilidad de que sea de origen germinal.
• panel_of_normals: Está presente en el PoN (Panel of Normals).
• low_allele_frac: La VAF está por debajo del umbral establecido.
• contamination: Señal de contaminación con tejido normal.
• orientation: Sesgo direccional entre F1R2 y F2R1 (artefacto de FFPE).
• read_position: Sesgo en la posición dentro del read.

Estas etiquetas se asignan a la columna FILTER del VCF. Solo PASS se incluye en el informe final.

Sesgo de orientación — La trampa de los tejidos FFPE

Una parte significativa de los tejidos tumorales corresponde a muestras fijadas en formalina e incluidas en parafina (FFPE). La fijación con formaldehído induce daños químicos específicos en el ADN.

• Las variantes C:G > T:A se observan únicamente en los reads de la dirección F1R2, pero no en los de F2R1.
• Este sesgo no corresponde a una variante real, sino a un artefacto del procesamiento de la muestra.

Mutect2 rastrea las observaciones por dirección (F1R2/F2R1) para detectar estadísticamente este sesgo. Si se utiliza la opción --f1r2-tar-gz para entrenar el modelo de orientación y se incorpora a FilterMutectCalls, el filtro se aplica automáticamente.

Cálculo manual — El ojo para la detección de baja VAF

Se observan 100 reads en una posición específica dentro del tumor, de los cuales 5 corresponden al alelo alternativo. La VAF es del 5%.

Desde la perspectiva germinal (HaplotypeCaller), esto se trataría como un error de secuenciación. Si fuera una variante heterocigota, se esperaría una VAF del 50%; por lo tanto, el 5% se considera dentro del rango de ruido.

Desde la perspectiva somática (Mutect2), la situación es diferente. ¿Cuál es la probabilidad de que estas 5 observaciones sean únicamente errores aleatorios?

• La tasa de error de secuenciación es aproximadamente 0.001 (Q30). La probabilidad de que 5 o más reads sean errores por casualidad entre 100 reads, calculada mediante una prueba binomial, es extremadamente baja.
• Conclusión: Candidato a variante real.

La razón por la cual se puede captar esta señal de baja VAF es que el modelo de verosimilitud de Mutect2 aprende la tasa de error de fondo para realizar pruebas de significancia.

Lectura de los campos somáticos en VCF

Los VCF somáticos contienen campos que no están presentes en los VCF germinales.

• AF (Frecuencia Alélica): VAF observada en el tumor. En la clínica, este valor sirve como indicador de la pureza tumoral y del tamaño del subclon.
• MMQ (MAPQ mediano): La mediana de los MAPQ de los reads utilizados para la llamada de variantes.
• MBQ (Calidad de base mediana): La mediana de la calidad de las bases después de BQSR.
• F1R2 / F2R1: Conteos de reads por dirección (diagnóstico del sesgo de orientación).

En los informes clínicos, se consideran como criterios básicos las tres condiciones siguientes: VAF ≥ 5%, MMQ ≥ 40 y equilibrio en la proporción F1R2/F2R1.

Consejos prácticos

Uso de gnomAD como recurso de línea germinal

af-only-gnomad.hg38.vcf.gz es el estándar: una versión reducida que contiene frecuencias alélicas poblacionales. Puede descargarse de Broad Resource Bundle.

Manejo de muestras tumorales con baja pureza

Si la pureza tumoral es inferior al 20 %, la mayoría de las variantes somáticas tendrán una VAF inferior al 10 %. Debe reducirse --min-allele-fraction en FilterMutectCalls, aunque hacerlo aumenta los falsos positivos.

Reducción del alcance mediante intervalos

Para un panel de genes del cáncer, restrinja el alcance con -L cancer_genes.bed para reducir el tiempo de ejecución.

Paralelización

Divida por cromosoma, ejecute en paralelo y combine al final con MergeVcfs.

No es práctico realizar ejercicios en Colab, se recomienda GCP Batch

Mutect2 consume muchos recursos y resulta difícil de ejecutar en Colab. En la práctica se utiliza un espacio de trabajo de Terra, Broad Institute, o GCP Batch. Para aprender, es más práctico ejecutar localmente con Docker los pequeños datos de ejemplo del tutorial oficial de Broad Institute.

Mapeo CS

• Prueba de razón de verosimilitudes (LRT): consulte el episodio de DryBench «Prueba de razón de verosimilitudes» (likelihood-ratio-testing).
• Modelado del ruido de fondo: el PoN utiliza como prior empírico la distribución del ruido de varias muestras normales.
• Detección de señales débiles: una VAF del 5 % implica aproximadamente una observación variante por cada veinte lecturas; se requiere una cobertura de al menos 100× para obtener potencia estadística.

Conclusión

Mutect2 añade un PoN y un modelo de sesgo de orientación al marco de la prueba de razón de verosimilitudes. En el siguiente episodio (S11) veremos cómo depurar estos VCF sin filtrar mediante VQSR y filtros duros, y cuáles son las reglas de decisión de ambos enfoques.

Si desea profundizar

• Cibulskis K. et al. (2013), Sensitive detection of somatic point mutations in impure and heterogeneous cancer samples. Nature Biotechnology 31:213. Artículo original de MuTect.
• Benjamin D. et al. (2019), Calling Somatic SNVs and Indels with Mutect2. bioRxiv. Artículo que amplía Mutect2.
• Tutorial de GATK Mutect2 (https://gatk.broadinstitute.org/hc/en-us/articles/360036713991): Fuente original de las opciones.
• Broad Institute BroadE — Somatic Short Variant Discovery Clase en YouTube. Visualización del proceso de creación de PoN.
• cBioPortal (https://www.cbioportal.org/): Catálogo de variantes somáticas reales, como TCGA, etc.

Cuando se comprenda intuitivamente por qué lo Germline y lo Somatic son estadísticamente diferentes, la elección del pipeline de llamado clínico será mucho más clara. En la próxima entrega, pasaremos a VQSR y Hard Filter.