¿Por qué es necesario el recorte?

Una vez que hemos abierto el FASTQ, debemos limpiar los datos antes de introducirlos en la tubería de procesamiento (pipeline). ¿Qué ocurre si no realizamos esta limpieza y enviamos los datos directamente al alineador?

• Quedan secuencias adaptadoras en el extremo 3′ de las lecturas, lo que genera un gran número de lecturas que no se alinean con el genoma de referencia.
• Las colas de baja calidad en el extremo 3′ se cuentan como desajustes (mismatches), provocando que GATK llame a variantes falsas.
• Los duplicados de PCR inflan las métricas de duplicación, distorsionando los cálculos de cobertura.

Es decir, el recorte no es una "opción estética", sino una tarea de consistencia necesaria para cumplir con los supuestos estadísticos de la tubería posterior. No nos apresuremos.

FastQC — ¿Qué debemos observar primero?

El informe de FastQC contiene más de veinte ítems, por lo que puede resultar abrumador al abrirlo por primera vez. En la práctica, definamos un orden específico para verificar solo los elementos clave cada vez.

1. Calidad de secuencia por base (diagrama de caja)

• Diagrama de caja que representa la posición de la lectura (eje x) frente a la puntuación Phred (eje y).
• Que la parte inicial de la lectura quede brevemente en la zona amarilla es normal (ruido durante la unión del cebador).
• Si la parte final cae por debajo del cuadro Q20 → se requiere recorte de calidad 3′.

2. Puntuaciones de calidad por secuencia (histograma)

• Distribución de los valores Q promedio de las lecturas.
• Es normal que haya un pico bien definido cerca de Q30.
• Si aparece un segundo pico entre Q10 y Q15 → sospecha de fallo en la preparación de la librería.

3. Secuencias sobrerepresentadas (tabla)

• Aparecen aquí las secuencias específicas que se repiten más del 0,1 % de las lecturas.
• FastQC las compara con su propia base de datos de adaptadores y asigna coincidencias como TruSeq Adapter Index 1.
• Cuando aparece este nombre → se requiere recorte de adaptadores.

4. Contenido de adaptadores (gráfico de líneas)

• Proporción de presencia de adaptadores en función de la posición de la lectura.
• Si aumenta bruscamente hacia el extremo 3′, indica que se ha producido una lectura a través del adaptador (el inserto era más corto que la longitud de la lectura, por lo que la secuenciadora leyó hasta el adaptador).

Con solo verificar estos cuatro puntos de manera rigurosa, el resto de los ítems se interpretarán con naturalidad.

¿Qué son los adaptadores — comprensión sin imágenes?

El inserto de una librería de Illumina tiene esta estructura:

[P5] - [índice i5] - [cebador Rd1] - [inserto de ADN] - [cebador Rd2] - [índice i7] - [P7]

El secuenciador comienza desde el cebador Rd1 y lee en dirección hacia el inserto. Sin embargo, si el inserto es más corto que la longitud de lectura (por ejemplo, 150 pb), ¿qué ocurre? El secuenciador sigue leyendo honestamente y deja intacta la secuencia del cebador Rd2 del lado opuesto más allá del final del inserto en la lectura. Esta es la verdadera naturaleza del "adaptador" que se une al extremo 3′.

Es decir, los adaptadores tienen secuencias fijas según el protocolo de la biblioteca. Para TruSeq es AGATCGGAAGAGC... y para Nextera es CTGTCTCTTATACACATCT. Las herramientas de recorte detectan estas secuencias conocidas mediante coincidencia de sufijos en el extremo 3′ de las lecturas.

fastp: la herramienta actual de un solo paso

Anteriormente se utilizaban por separado FastQC, Trim Galore y cutadapt; desde 2018, la mayoría se ha consolidado en fastp. Las razones son tres:

• Velocidad: Está escrito en C++ y permite procesamiento paralelo. Procesa archivos de 30 GB en menos de 5 minutos.
• Detección automática de adaptadores: Detecta estadísticamente las secuencias superpuestas en las lecturas, permitiendo el recorte incluso sin conocer el protocolo.
• Informe JSON: Genera simultáneamente informes similares a los de FastQC en formatos JSON y HTML, que pueden integrarse directamente en MultiQC.

Ejecución básica

fastp \
  -i sample_R1.fastq.gz \
  -I sample_R2.fastq.gz \
  -o clean_R1.fastq.gz \
  -O clean_R2.fastq.gz \
  --detect_adapter_for_pe \
  --qualified_quality_phred 20 \
  --length_required 50 \
  --json report.json \
  --html report.html

Analicemos solo tres líneas de opciones.

• --detect_adapter_for_pe: Detección automática de adaptadores mediante la superposición de R1/R2 en lecturas de extremo emparejado (paired-end).
• --qualified_quality_phred 20: Recorte de regiones con calidad media Q20 o inferior utilizando una ventana deslizante desde el final de la lectura.
• --length_required 50: Descarte de lecturas menores de 50 pb después del recorte.

Trim Galore — una fina capa sobre cutadapt

El estándar de la era anterior a fastp. Trim Galore invoca internamente a cutadapt y proporciona un conjunto predefinido básico para adaptadores humanos y de ratón. Para el mantenimiento de tuberías (pipelines) existentes, sigue siendo una opción segura.

trim_galore --paired --quality 20 --length 50 \
    -o clean/ sample_R1.fastq.gz sample_R2.fastq.gz

Conocer tres opciones, --paired, --quality y --length, cubre la mayoría de las necesidades prácticas.

¿fastp o Trim Galore?

• Proyecto nuevo: priorice fastp por su velocidad, detección automática e informe integrado.
• Mantenimiento de Snakemake/Nextflow existente: conserve la herramienta original de la canalización para mantener la compatibilidad.
• Reproducción de un artículo: utilice exactamente la herramienta especificada en el artículo para preservar la reproducibilidad.

Estos tres principios resuelven la mayoría de las decisiones sobre herramientas.

Cálculo manual: cómo funciona realmente la ventana deslizante

El núcleo del recorte por calidad es una ventana deslizante desde el extremo 3′. Con una ventana de tamaño 4 y un umbral Q20, la decisión se toma de la siguiente manera.

Supongamos que el vector de calidad del extremo de la lectura es el siguiente.

... Q35 Q33 Q30 Q28 | Q22 Q18 Q15 Q10

Se desplaza una ventana de tamaño 4 hacia la izquierda desde el extremo 3′ y se calcula su media.

En el primer punto que supera el umbral Q20, dos pasos a la izquierda con una media de 24,5, se descarta todo lo situado a la derecha. El resultado recortado conserva la secuencia hasta ... Q35 Q33 Q30 Q28.

Esta ventana deslizante representa la operación realizada por --cut_tail --cut_tail_mean_quality 20 de fastp, --quality 20 de Trim Galore y -q 20 de cutadapt.

Práctica sin código en Galaxy EU

Si la CLI resulta incómoda, Galaxy Europe permite ejecutar gratuitamente el mismo trabajo mediante una interfaz gráfica. Ofrece 250 GB de almacenamiento gratuito y flujos preconfigurados para Trim Galore, fastp y FastQC.

1. Cree una cuenta y después un historial.
2. Utilice Upload Data para cargar un FASTQ de ejemplo o introduzca directamente una URL de EBI ENA.
3. Busque FastQC en Tools, seleccione el archivo de lecturas y ejecútelo.
4. Busque fastp, elija paired-end y especifique R1 y R2.
5. Ejecute MultiQC para integrar los resultados de FastQC y fastp en una sola página.

Un flujo sin código facilita que otros miembros del equipo reproduzcan posteriormente la canalización.

MultiQC: combinación de informes

Ver 30 muestras individualmente como informes de FastQC es un infierno. Ejecutar MultiQC escanea automáticamente todos los informes en la carpeta (FastQC, fastp, STAR, samtools, GATK) y los combina en un solo archivo HTML.

multiqc . -o multiqc_report/

Esta es la línea de comandos más querida en la práctica profesional. En las reuniones del equipo, ante la pregunta "¿cómo fue el secuenciamiento de ayer?", respondo con esta única página HTML.

Mapeo CS — Ventana deslizante y coincidencia de sufijos

• Promedio de ventana deslizante: El recorte por calidad es la versión práctica de bioinformática del capítulo "Fundamentos de la ventana deslizante" de DryBench.
• Coincidencia de sufijos (aproximada): La detección de adaptadores implica una coincidencia aproximada entre el sufijo 3′ del read y la secuencia conocida del adaptador. Es un problema de búsqueda de sufijos que permite k desajustes.
• Filtro de flujo (pipe Unix): fastp admite stdin/stdout por sí mismo, lo que permite integrarlo en pipelines; es posible realizar streaming como zcat | fastp | bwa mem.

Reglas de decisión práctica — ¿Qué y cuánto recortar?

Al recibir un nuevo proyecto, tome las decisiones en el siguiente orden.

1. Verificar la detección de adaptadores: Gráfico "Adapter Content" de FastQC. Si sube más del 5% en el extremo 3′ → el recorte es obligatorio.
2. Selección del umbral de calidad:
   • WGS/WES para detección de variantes → Q20.
   • Cuantificación de RNA-seq → Q15 (existe la preocupación de que el recorte pueda inducir sesgo en la cuantificación; la tendencia reciente es minimizar el recorte).
   • Lecturas largas para ensamblaje → Q7～Q10 (originalmente bajas).
3. Umbral de longitud: Se recomienda al menos 50bp según los requisitos del alineador. Para ensamblaje, se recomiendan al menos 100bp.
4. Monitoreo de la tasa de descarte: Si la pérdida de reads tras el recorte supera el 20%, se debe reexaminar la propia biblioteca.

Estos cuatro puntos determinan la calidad de entrada del siguiente capítulo (S03 BWA-MEM).

Conclusión

Informe con FastQC, recorte con fastp y combine con MultiQC. Estas tres herramientas aparecerán repetidamente a lo largo de los próximos 25 capítulos. En el próximo capítulo S03, alinearemos realmente los reads ordenados contra el genoma de referencia. Veamos por qué BWA-MEM sigue siendo el estándar y cómo la cuadrícula de Needleman-Wunsch aprendida en M06 se reutiliza localmente dentro de él.

Para profundizar más

• Andrews S. (2010), FastQC: A Quality Control Tool for High Throughput Sequence Data. Documentación oficial de Babraham Bioinformatics. El trasfondo teórico de cada elemento de FastQC.
• Chen S. et al. (2018), fastp: an ultra-fast all-in-one FASTQ preprocessor. Bioinformatics 34:i884. El artículo original de fastp.
• Krueger F., Trim Galore! User Guide. Babraham Bioinformatics. Antecedentes del diseño de Trim Galore y mapeo de opciones de cutadapt.
• EMBL-EBI Training — QC and Trimming (https://www.ebi.ac.uk/training/) serie de tutoriales gratuitos. No dispone de subtítulos en español, pero se puede utilizar la traducción automática.
• Galaxy Training Network — Quality Control tutorial. Material original de la práctica de Galaxy EU mencionada anteriormente.

Ejecutar fastp una vez en Colab y generar un informe con MultiQC facilitará la transición al siguiente episodio. Es necesario abrir, recortar y combinar las lecturas.