Limitaciones de ChIP-seq: un solo objetivo a la vez

En S38 se analizaron las posiciones de unión de una modificación histónica específica o de un factor de transcripción mediante ChIP-seq. Sin embargo, ChIP-seq tiene una limitación fundamental: un solo experimento con un solo anticuerpo, es decir, un solo objetivo. Si se analiza H3K4me3, para observar H3K27ac se requiere otro experimento. Para analizar cientos de factores de transcripción, sería necesario realizar cientos de experimentos.

ATAC-seq (Assay for Transposase-Accessible Chromatin with sequencing) supera este problema. No utiliza anticuerpos. En su lugar, analiza todos los sitios donde la cromatina está abierta simultáneamente. La transposasa Tn5 no puede acceder a la cromatina cerrada, densamente empaquetada por histonas, sino que se inserta únicamente en la cromatina abierta (promotores, potenciadores y sitios de unión de factores de transcripción). Como resultado, con un solo experimento de ATAC-seq se puede trazar el paisaje regulador completo de la célula.

Principio de la transposasa Tn5

El reactivo clave de ATAC-seq es la transposasa Tn5. Esta enzima reconoce el ADN de doble cadena e inserta directamente adaptadores de secuenciación (tagmentación). En la cromatina abierta, el ADN está expuesto, por lo que la Tn5 puede insertarse libremente; en cambio, en las regiones cerradas envueltas por nucleosomas, el acceso queda bloqueado.

El flujo de trabajo experimental es sorprendentemente breve:

1. Se aíslan los núcleos celulares (eliminando el ADN citoplasmático).
2. Se añade Tn5 y se incuba a 37 °C durante 30 minutos.
3. Se purifica el ADN y se amplifica mediante PCR.
4. Se realiza la secuenciación.

En comparación con el proceso completo de ChIP-seq (cross-linking, fragmentación, IP, purificación y preparación de la librería), el ATAC-seq se completa en pocas horas con entre 500 y 50,000 células. Esta sencillez es la razón principal de su rápida adopción.

Corrección +4/-5 de la inserción de Tn5

Cuando la Tn5 se inserta en el ADN de doble cadena, se genera una duplicación del sitio diana (target site duplication) de 9 pb. Por lo tanto, para representar con precisión la "posición real de corte", es necesario corregir el extremo 5' de la lectura positiva (+) con +4 pb y el extremo 5' de la lectura negativa (-) con -5 pb. Sin esta corrección, la resolución del análisis de huella (footprinting) disminuye.

Distribución del tamaño de fragmentos: señal de periodicidad nucleosomal

Los datos de ATAC-seq de buena calidad muestran patrones distintivos en la distribución del tamaño de fragmentos:

• < 100 pb: Regiones libres de nucleosomas (NFR, Nucleosome-Free Region) — cromatina abierta. Esta es la señal principal de ATAC-seq.
• ～200 pb: Mononucleosoma (fragmento que envuelve un solo nucleosoma)
• ～400 pb: Dinucleosoma
• ～600 pb: Trinucleosoma

Este patrón periódico (repetición de ~147 pb de nucleosoma + ~50 pb de ADN de unión) es una prueba directa de que la Tn5 se inserta únicamente en el ADN de unión entre los nucleosomas. Es el primer punto de control de calidad.

# Visualización de la distribución del tamaño de fragmentos (deepTools)
bamPEFragmentSize -b atac_sorted.bam -o frag_size.png --maxFragmentLength 1000

Detección de picos: diferencias con ChIP-seq

Se puede utilizar MACS para la detección de picos en ATAC-seq, pero se requieren algunos ajustes.

# Detección de picos MACS2 para ATAC-seq
macs2 callpeak \
  -t atac_shifted.bam \
  -f BAMPE \          # extremo emparejado
  -g hs \
  -n sample_ATAC \
  --nomodel \         # omitir modelado del tamaño de fragmento (Tn5 inserta directamente)
  --shift -75 --extsize 150 \  # Detección del centro NFR
  --keep-dup all \
  -q 0.05

--nomodel: El modelo de desplazamiento de lecturas de ChIP-seq no es compatible con la inserción de Tn5, por lo que se desactiva.

-f BAMPE: En el modo paired-end, se utiliza el tamaño real del fragmento.

Picos NFR vs. picos de nucleosomas

En el análisis de cromatina abierta, normalmente solo se utilizan las lecturas de fragmentos NFR (< 150 pb). Para analizar el posicionamiento de nucleosomas, se extraen por separado los fragmentos de mononucleosomas (150～300 pb).

# Extraer solo fragmentos NFR (< 150bp)
samtools view -h atac_sorted.bam | \
  awk 'substr($0,1,1)=="@" || ($9>0 && $9<150) || ($9<0 && $9>-150)' | \
  samtools view -bS - > atac_nfr.bam

# Extraer fragmentos de mononucleosoma (150-300bp)
samtools view -h atac_sorted.bam | \
  awk 'substr($0,1,1)=="@" || ($9>=150 && $9<=300) || ($9<=-150 && $9>=-300)' | \
  samtools view -bS - > atac_mono.bam

Huella de los factores de transcripción

Una de las aplicaciones más elegantes de ATAC-seq es el footprinting (huella). Cuando un factor de transcripción se une al ADN, protege el sitio de unión de la Tn5. Por lo tanto, si se observa una pequeña depresión (dip) dentro de los picos de cromatina abierta, es probable que un factor de transcripción esté unido en esa posición.

El análisis de footprinting se realiza siguiendo estos pasos:

1. Buscar en el genoma los motivos de los factores de transcripción de interés (por ejemplo, CTCF, AP-1).
2. Calcular la densidad de inserciones de Tn5 alrededor de todos los sitios de los motivos.
3. Si la densidad de inserciones disminuye en el centro del motivo (footprint), esto es evidencia de que el factor de transcripción se encuentra unido en estado activo.

# Análisis de footprinting con TOBIAS (línea de comandos)
# Paso 1: Corrección del sesgo de inserción Tn5
# tobias ATACorrect -b atac.bam -g genome.fa -p peaks.bed -o corrected/

# Paso 2: Cálculo de la puntuación de huella
# tobias FootprintScores -s corrected/atac_corrected.bw -r peaks.bed -o scores.bw

# Paso 3: Visualización de huellas por motivo
# tobias PlotAggregate -m motifs.jaspar -s corrected/atac_corrected.bw -r peaks.bed -o footprint.pdf

El footprint de CTCF se manifiesta como una depresión profunda y aguda, lo que indica que CTCF se une al ADN con gran estabilidad. Por el contrario, algunos factores de transcripción tienen tiempos de unión cortos, por lo que su footprint es superficial.

ATAC-seq de célula única: scAT-seq

Si el ATAC-seq de conjunto (bulk) representa el promedio del tejido, scATAC-seq mide la accesibilidad de la cromatina en células individuales. 10x Genomics Multiome (medición simultánea de RNA + ATAC) es un ejemplo representativo.

Las herramientas de análisis principales son ArchR (R) y Signac (basado en Seurat para R). Dado que los datos de scATAC-seq son muy dispersos (sparse), primero se definen los picos, luego se crea una matriz de célula × pico, se reduce la dimensionalidad mediante LSI (Latent Semantic Indexing) y finalmente se realiza el clustering. Es el pipeline correspondiente al PCA + UMAP de RNA-seq.

Mapeo CS

• Sesgo de alineación por inserción: La preferencia de secuencia de Tn5 (sesgo de inserción) es un sesgo sistemático en los datos. Corregirlo equivale a una calibración para eliminar el sesgo instrumental de los datos observados.
• Señal periódica y FFT: Detectar la periodicidad del nucleosoma (~200 bp) en la distribución de tamaños de fragmentos sigue la misma lógica que el análisis de frecuencia (Fast Fourier Transform).
• Coincidencia de patrones (footprinting): Buscar sitios de unión en el genoma a partir de una base de datos de motivos es la versión biológica de la coincidencia de patrones de cadenas de texto.

Defectos comunes

• Exceso de lecturas mitocondriales: El ADN mitocondrial no está empaquetado como cromatina, por lo que Tn5 realiza inserciones masivas. Si la proporción de lecturas mitocondriales supera el 50%, indica una separación nuclear incompleta y deben eliminarse antes del análisis.
• No eliminación de duplicados de PCR: El ATAC-seq parte de cantidades mínimas de ADN, por lo que la amplificación por PCR es intensa y genera muchos duplicados. Es obligatorio eliminarlos con MarkDuplicates (S07).
• Falta de corrección de inserción de Tn5 (+4/-5): Sin esta corrección durante el análisis de footprinting, los sitios de unión se desplazan 9 bp y el footprint se vuelve difuso.
• No separación de fragmentos NFR: Si se detectan picos en todos los fragmentos, las señales del nucleosoma y del NFR se mezclan, dificultando la interpretación. Se recomienda la separación por tamaño de fragmento.

Para profundizar más

El presente texto es una descripción reconstruida directamente por BPD. Para un estudio avanzado, utilice los materiales canónicos que se indican a continuación.

• Artículo original (ATAC-seq): Buenrostro et al. (2013), Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position, Nature Methods 10:1213. Es la fuente del método para medir la accesibilidad de la cromatina en 50.000 células.
• Pipeline de ATAC-seq de ENCODE: Proyecto ENCODE (encodeproject.org/atac-seq/) — pipeline de análisis estándar y especificaciones de calidad.
• Clase MIT 6.874 (Kellis): Las clases sobre accesibilidad de la cromatina y epigenética cubren los fundamentos estadísticos de ATAC-seq.
• TOBIAS footprinting: Bentsen et al. (2020), ATAC-seq footprinting unravels kinetics of transcription factor binding during zygotic genome activation, Nature Communications 11:4267.
• ArchR (scATAC-seq): Granja et al. (2021), ArchR is a scalable software package for integrative single-cell chromatin accessibility analysis, Nature Genetics 53:403.

Si ATAC-seq analizó la accesibilidad 2D de la cromatina, en el siguiente episodio S40 elevamos la dimensión con Hi-C — la tecnología para descifrar la estructura de contacto 3D del genoma.