qPCR CNV — 상대정량이 copy number가 되기까지
왜 알아야 하는가
qPCR은 특정 DNA 구간의 양을 빠르고 비교적 좁게 측정할 수 있어 deletion·duplication 후보를 확인하거나 알려진 locus의 copy number를 추정하는 데 쓰입니다. 그러나 장비가 copy number를 직접 세는 것은 아닙니다. amplification이 기준 시료보다 몇 cycle 일찍 또는 늦게 검출되는지를 상대정량하고, 여러 전제가 맞을 때 그 차이를 copy number로 해석합니다.
qPCR과 RT-qPCR도 구분해야 합니다. qPCR은 측정 방식을 가리키며 DNA template를 사용할 수 있습니다. RT-qPCR은 RNA를 reverse transcription해 만든 cDNA를 측정합니다. CNV를 genomic DNA에서 볼 때와 gene expression을 RNA에서 볼 때는 질문과 control이 완전히 다릅니다.
Cq가 의미하는 것
PCR cycle이 반복되면 표적 산물이 늘고 fluorescence가 threshold를 넘는 시점이 Cq로 기록됩니다. 시작 template가 많을수록 보통 더 이른 cycle에서 threshold에 도달합니다. 이상적인 효율에서는 한 cycle 차이가 약 두 배 차이를 나타내지만 실제 효율은 primer, amplicon과 검체에 따라 달라집니다.
표적 Cq만 비교하면 DNA 투입량과 품질 차이를 CNV로 오해할 수 있습니다. 같은 검체의 안정적인 reference locus와 비교해 ΔCq를 만들고, 알려진 diploid calibrator와 다시 비교해 ΔΔCq를 계산합니다. 이 계산은 target과 reference의 amplification efficiency가 충분히 비슷하다는 전제가 필요합니다.
CNV 추정의 설계
assay 위치는 CNV 안에 실제 포함되어야 합니다. exon 하나의 deletion을 찾는 primer가 변하지 않은 exon에 놓이면 정상으로 보일 수 있습니다. 큰 duplication도 한 점의 qPCR로는 전체 경계와 배열 방향을 알 수 없습니다. 여러 exon 또는 경계 후보에 assay를 배치해 패턴을 확인할 수 있습니다.
reference locus는 연구 대상에서 copy number가 안정적이고 target과 비슷한 품질로 증폭돼야 합니다. diploid control, 양성 control과 no-template control을 포함하고 기술 replicate의 분산을 확인합니다. 표준곡선으로 efficiency와 dynamic range를 검증하는 것도 중요합니다.
작은 예시
정상 대조군과 비교해 한 exon의 상대량이 반복 측정에서 약 절반으로 나타나고 인접 exon은 정상이라면 heterozygous exon deletion 가설을 세울 수 있습니다. 하지만 primer-binding site의 SNV가 한 allele 증폭을 막아 같은 패턴을 만들 수도 있습니다. 다른 primer set이나 MLPA·sequencing 같은 독립 방법으로 확인해야 합니다.
약 두 배 신호가 나타나도 tandem duplication인지 다른 위치에 삽입된 사본인지, 어느 allele에 있는지는 qPCR만으로 알기 어렵습니다.
MIQE와 기록할 정보
재현 가능한 qPCR에는 검체 추출법, DNA 품질·양, primer sequence 또는 assay ID, amplicon, efficiency, threshold 설정, replicate, 제외 기준과 계산법이 필요합니다. 결과값만 남기면 다른 실험실이 같은 copy-number call을 재현하기 어렵습니다.
batch마다 calibrator와 control을 두고 plate position과 operator effect를 살펴야 합니다. 소수점 copy-number 추정치를 실제 세포의 정수 사본 수처럼 과해석하지 않습니다.
혼동하기 쉬운 점
- ΔΔCq는 모든 조건에서 자동으로 성립하는 공식이 아닙니다.
- 상대량 0.5 또는 1.5가 곧 확정 deletion·duplication을 뜻하지 않습니다.
- genomic CNV qPCR과 RNA expression RT-qPCR은 서로 대체하지 않습니다.
- 높은 replicate 일치도는 체계적인 primer bias를 배제하지 않습니다.
해석 경계
qPCR은 표적 locus의 상대 copy number를 좁게 검사하지만 breakpoint, complex rearrangement, tumor purity와 mosaicism을 단독으로 해결하지 못합니다. 임상 call에는 assay별 validation과 독립 확인법이 필요합니다.
연결해서 읽기
검사법 선택과 blind spot은 WGS·WES·panel, 구조변이 annotation은 AnnotSV, allele fraction과 mosaicism은 Germline과 somatic VAF Concept과 연결됩니다.