ATAC-seq — 열린 염색질을 직접 본다는 말의 범위
왜 알아야 하는가
같은 DNA 서열을 가진 세포도 어떤 조절영역을 열어 두는지에 따라 서로 다른 유전자를 사용할 수 있습니다. ATAC-seq은 비교적 적은 세포에서 chromatin accessibility를 genome-wide로 추정해 세포 상태와 조절요소 후보를 찾는 방법입니다. 다만 “열린 염색질을 직접 본다”는 표현은 측정 원리를 지나치게 단순화할 수 있습니다.
ATAC-seq signal은 transposase가 DNA에 접근하고 adapter를 삽입할 수 있었던 사건의 집합입니다. accessibility와 관련되지만 핵 위치, chromatin 구조, sequence bias와 실험 조건의 영향을 함께 받습니다.
Tn5와 tagmentation
adapter가 미리 결합된 Tn5 transposase는 접근 가능한 DNA를 절단하면서 adapter를 삽입합니다. 생성된 fragment를 PCR 증폭하고 sequencing한 뒤 reference genome에 정렬합니다. read 시작점은 Tn5 insertion 위치를 반영하도록 offset을 보정할 수 있습니다.
짧은 fragment는 nucleosome-free region, 더 긴 fragment의 주기성은 mono·di-nucleosome 보호와 관련될 수 있습니다. 이 패턴은 library 품질을 보여주지만 모든 세포형에서 동일한 모양과 cutoff를 기대해서는 안 됩니다.
Peak가 뜻하는 것
peak caller는 배경보다 insertion이 농축된 영역을 찾습니다. peak는 promoter, enhancer 또는 다른 accessible region 후보가 될 수 있습니다. peak가 있다는 사실만으로 특정 transcription factor가 결합했거나 주변 gene이 발현된다고 결론 내릴 수 없습니다.
motif enrichment와 footprinting은 가능한 factor를 제안하지만 motif를 공유하는 단백질, Tn5 bias와 sequencing depth의 영향을 받습니다. TF binding은 ChIP 계열이나 perturbation 같은 독립 증거로 확인해야 합니다.
품질관리 읽기
TSS enrichment는 annotated transcription start site 주변 신호가 배경보다 뚜렷한지, FRiP는 전체 mapped read 중 peak 안에 든 비율을 봅니다. library complexity, duplicate, mitochondrial read 비율, fragment-size periodicity와 replicate concordance도 함께 평가합니다. 지표 하나가 좋다고 전체 library가 합격하는 것은 아닙니다.
세포 사멸, 과도한 lysis와 nuclei preparation 차이는 background를 높일 수 있습니다. 조직과 protocol에 따라 정상 범위가 다르므로 보편적인 단일 cutoff보다 같은 실험 설계 안의 분포와 재현성을 봅니다.
작은 비교 예시
자극 전후 면역세포에서 enhancer 후보의 ATAC peak가 커졌다고 합시다. 이는 자극 뒤 그 영역의 접근성이 증가했다는 증거입니다. 같은 영역의 histone mark, nearby gene expression과 TF binding이 같은 방향으로 변하면 조절 가설이 강해집니다. enhancer deletion이나 motif editing이 발현·세포 phenotype을 바꾸는지 확인해야 기능적 인과로 이동할 수 있습니다.
bulk ATAC에서는 특정 세포형 비율이 늘어난 것과 같은 세포 안 accessibility가 변한 것을 구분하기 어렵습니다.
Single-cell ATAC-seq
single-cell ATAC-seq은 세포별 accessible fragment를 분리해 cell type과 상태를 추정합니다. 한 세포에서 관찰되는 fragment 수가 적어 matrix가 매우 sparse하며, 여러 cell을 합친 pseudo-bulk와 topic model을 활용하기도 합니다. doublet, low-quality nucleus와 batch가 cluster를 만들지 않는지 점검합니다.
RNA와 함께 측정하거나 computational integration할 수 있지만 두 modality의 연결은 모형에 의존합니다. accessibility가 곧 expression이라는 등식은 성립하지 않습니다.
혼동하기 쉬운 점
- open chromatin은 항상 active enhancer를 뜻하지 않습니다.
- peak 높이는 세포 수, depth와 normalization의 영향을 받습니다.
- motif 존재는 TF binding 증거가 아닙니다.
- bulk 차이는 세포 조성 변화일 수 있습니다.
- single-cell cluster label은 독립 marker와 생물학적 검증이 필요합니다.
해석 경계
ATAC-seq은 accessibility의 대리측정이며 gene expression, TF binding과 disease causality를 단독으로 증명하지 않습니다. sample preparation, QC, replicate와 관련 세포 맥락이 결과의 일부입니다.
연결해서 읽기
accessible variant에서 target gene으로 가는 과정은 Non-coding GWAS와 chromatin contact, expression association은 eQTL, perturbation 검증은 CRISPR/Cas9 Concept과 연결됩니다.