Germline과 somatic — VAF를 단순 규칙으로 읽지 않기
왜 알아야 하는가
유전체 검사에서 변이를 찾은 뒤에는 그 변이가 몸 전체에 존재하는지, 특정 조직이나 종양에서 생겼는지를 구분해야 합니다. germline variant는 수정란에서 시작해 여러 조직과 생식세포에 존재할 수 있고 다음 세대로 전달될 가능성이 있습니다. somatic variant는 수정 후 특정 세포 계통에서 생겨 그 후손 세포에 제한됩니다.
하지만 실제 생물학은 둘로 깨끗하게 나뉘지 않습니다. 발생 중간에 생긴 변이는 일부 정상 조직에만 존재하는 mosaicism을 만들 수 있고, 혈액세포에서 후천적으로 생긴 clone은 혈액검사에서 germline처럼 보일 수 있습니다. 따라서 검체 한 개의 숫자만으로 기원을 단정하면 안 됩니다.
핵심 개념
VAF(variant allele fraction)는 해당 위치를 읽은 sequence read 가운데 변이 allele을 지지하는 비율입니다. 이상적인 diploid 정상 검체에서 heterozygous germline variant는 약 50%, homozygous variant는 거의 100%에 가까울 수 있습니다. 그러나 이 값은 기대치일 뿐 판정선이 아닙니다. sampling variation, mapping bias, copy number와 검체 혼합이 실제 값을 움직입니다.
종양 검체의 VAF는 더 복잡합니다. 종양세포 비율, 변이가 존재하는 clone의 비율, 해당 locus의 증폭·결실, loss of heterozygosity와 정상세포 혼입이 합쳐진 결과입니다. 같은 VAF라도 서로 다른 생물학적 시나리오가 가능하고, 높은 VAF가 반드시 germline을 뜻하지 않으며 낮은 VAF가 반드시 sequencing error도 아닙니다.
숫자로 생각해 보는 예시
종양세포에 heterozygous variant가 있고 copy number가 정상이며 검체의 절반만 종양세포라면 단순 기대 VAF는 약 25%가 될 수 있습니다. 하지만 변이 allele이 증폭되거나 반대 allele이 소실되면 값은 높아집니다. 반대로 변이가 일부 subclone에만 있으면 더 낮아집니다.
정상 혈액에서 약 10% VAF가 관찰됐다고 해도 low-level mosaicism, clonal hematopoiesis, 오염과 기술 오류를 구분해야 합니다. 숫자는 가설을 좁히지만 origin을 스스로 증명하지 않습니다.
matched normal이 하는 일
종양과 정상 검체를 함께 분석하면 두 검체에 공통인 variant와 종양에 농축된 variant를 비교할 수 있습니다. 그렇다고 혈액 하나가 항상 완벽한 정상 대조군은 아닙니다. 혈액암, 조혈계 mosaicism이나 clonal hematopoiesis가 의심되면 피부 fibroblast 등 다른 조직이 필요할 수 있습니다.
가족검사는 유전 가능성과 분리를 평가하는 데 도움을 주지만 환자의 조직 mosaicism을 모두 배제하지는 못합니다. 검사 목적에 맞는 검체 선택이 분석 알고리즘만큼 중요합니다.
Depth와 검출한계
read depth는 관찰 기회를 늘리지만 assay 성능 전체를 대표하지 않습니다. 낮은 allele fraction을 검출하려면 library preparation, unique molecule 수, base·mapping quality, strand balance와 위치별 오류 양상을 함께 검증해야 합니다. PCR duplicate를 포함한 수천 read가 수천 개의 독립 분자를 뜻하지 않을 수도 있습니다.
검사실은 variant type과 allele fraction별 limit of detection, 민감도, 특이도와 재현성을 정합니다. SNV에 대한 성능을 indel, CNV나 구조변이에 그대로 적용할 수 없습니다.
혼동하기 쉬운 점
- VAF와 세포 비율은 같은 값이 아닙니다.
germline은 병원성을 뜻하지 않고,somatic도 암 driver를 뜻하지 않습니다.- 종양-only 검사에서 가능한 germline 소견과 확정 germline 결과를 구분해야 합니다.
- 높은 depth는 상동영역의 잘못된 mapping이나 체계적 오류를 자동 해결하지 않습니다.
한계
VAF 해석에는 검체 종류와 채취 시점, tumor purity 추정법, local copy number, 치료 이력과 pipeline version이 필요합니다. 이 정보가 없으면 정교한 소수점도 불확실한 측정치에 불과합니다. 임상적 origin 확인은 독립 정상 조직과 검증된 germline assay가 필요할 수 있습니다.
연결해서 읽기
두 변이의 allele 배치를 다루는 Compound heterozygous와 phase, 검사 범위와 blind spot을 비교하는 WGS·WES·panel 선택 Concept과 연결됩니다.