Una npegRNA con secuencias de edición en un bucle interno del ARN guía aumenta la eficiencia de la edición prime
Antecedentes: límites de eficiencia de la entrega de RNP
Una pegRNA no convencional (npegRNA), que sitúa las secuencias de edición en un bucle interno del ARN guía, aumentó el rendimiento de edición en experimentos de edición prime (PE) con entrega de ribonucleoproteínas (RNP). El equipo informó de mejoras en las tasas de edición precisa en varios sitios genómicos y tipos celulares.
La PE es una tecnología de edición genética que utiliza un ARN guía para edición prime (pegRNA) para realizar modificaciones genéticas precisas. En las pegRNA convencionales, la plantilla de transcripción inversa (RTT) y el sitio de unión del cebador (PBS) están unidos al extremo 3′ del ARN guía.
La entrega de complejos de PE como RNP tiene potencial para aplicaciones terapéuticas, pero la baja eficiencia de edición genómica sigue siendo un obstáculo. Este estudio analizó si modificar la estructura del ARN guía podía mejorar el rendimiento de edición con este método de entrega.
Hallazgos principales: diseño con un bucle interno y mejora del rendimiento de edición
El equipo desarrolló una npegRNA que incorpora la RTT y el PBS en un bucle interno de un único ARN guía. Este diseño cambia la ubicación de las secuencias utilizadas para la edición.
La npegRNA unida a la proteína Cas9 mostró mayor resistencia a la degradación por exonucleasas. Los investigadores plantearon que esta característica podría haber aumentado la eficiencia con la que los complejos de PE actúan sobre su diana en células vivas. Sin embargo, el resumen proporcionado no permite determinar cuánto se prolongó su permanencia dentro de las células.
En experimentos de entrega de RNP para PE, el rendimiento de edición de la npegRNA fue, en promedio, 26,8 veces mayor que con la pegRNA convencional y 5,9 veces mayor que con la pegRNA mejorada (epegRNA). Estas son mejoras relativas obtenidas en las condiciones experimentales y no representan tasas absolutas de edición.
También se observó una mejora de eficiencia en experimentos que introdujeron variantes asociadas a enfermedades. En experimentos con células humanas, incluidas células T Jurkat y células madre pluripotentes inducidas (iPSC), la eficiencia de introducción de variantes con RNP basadas en npegRNA fue hasta 123 veces mayor. El resumen no especifica la combinación de célula y diana que produjo este valor máximo. Como estos resultados consisten en introducir variantes asociadas a enfermedades, deben distinguirse de la corrección terapéutica que revierte las variantes patológicas a la secuencia normal.
Significado y perspectivas: de la corrección en ratones a la validación posterior
El equipo también informó de una mejora de la corrección génica con fines terapéuticos en un modelo de ratón con tirosinemia. El cambio en la estructura del ARN guía mejoró así el rendimiento de corrección tanto en experimentos celulares como en un modelo animal.
Sin embargo, todavía es pronto para interpretar estos resultados como una demostración de eficacia terapéutica frente a enfermedades genéticas difíciles de tratar o como el establecimiento de un estándar para la terapia génica de próxima generación. El material disponible es el resumen del artículo científico; las tasas absolutas de corrección en ratones, la mejoría de los síntomas, la supervivencia y los datos de seguridad quedan fuera del alcance de la información disponible. Para determinar si las mejoras relativas de rendimiento se traducen en resultados suficientes para un uso práctico, será necesario evaluar las tasas absolutas de edición por diana, las condiciones de entrega, la edición fuera de objetivo y la toxicidad.
El estudio puede consultarse en el resumen y la información bibliográfica del artículo publicado en Nature Biomedical Engineering.
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Prime editing (PE) enables precise genetic modifications using canonical prime editing guide RNA (pegRNA), with the reverse transcription template and primer binding site (RTT-PBS) attached to the 3' ends of CRISPR-Cas guide RNAs. Although PE ribonucleoprotein (RNP) delivery holds great therapeutic potential, its weak genomic editing capability limits therapeutic applications. Here we present structure-guided engineering of the PE complex using non-canonical pegRNAs (npegRNAs), with the RTT-PBS integrated within the single guide RNA loops, to improve PE efficiency. This approach demonstrates enhanced precise editing rates across various genomic sites and cell types, and improves therapeutic gene correction in a tyrosinaemia mouse model. Cas9-associated npegRNAs are more resistant to exonuclease degradation, probably enhancing the PE complex's targeting efficiency in living cells. Using PE RNP delivery, npegRNAs achieve increased average editing yields of 26.8-fold over canonical pegRNAs and 5.9-fold over engineered pegRNAs (epegRNAs). Furthermore, npegRNA-mediated RNPs increased the efficiency of installing disease-relevant mutations up to 123-fold in human cell lines, including Jurkat T cells and induced pluripotent stem cells. Collectively, our findings demonstrate a robust PE strategy and highlight the potential of npegRNAs for therapeutic PE applications.
En estudios que editan células con RNP de PE, la npegRNA puede evaluarse como diseño candidato en comparación con la pegRNA convencional y la epegRNA. Por ejemplo, en experimentos para crear modelos de investigación mediante la introducción de variantes asociadas a enfermedades en células humanas, comparar las tasas absolutas de edición con la misma diana y las mismas condiciones de entrega puede ayudar a determinar la utilidad práctica del diseño. La mejora de la corrección comunicada en ratones con tirosinemia también aporta una base para ampliar el trabajo hacia la investigación terapéutica. Sin embargo, la mejora de la eficiencia de introducción de variantes y el beneficio terapéutico son resultados distintos. Para evaluar su aplicación terapéutica habrá que determinar si se alcanzan tasas de corrección suficientes, evaluar la edición fuera de objetivo y la toxicidad, y comprobar si el efecto se mantiene.