Estrategia doble de CRISPR que evita cortes mortales en ADN abre camino para edición precisa de Leptospira
Contexto
Las bacterias del género Leptospira son patógenos que causan leptospirosis en humanos y ganado. Se establecen en los riñones de diversos animales y se excretan por la orina, contaminando el ambiente, pero los genes que determinan su patogenicidad y adaptación al huésped no están completamente caracterizados. La creación de cepas mutantes para verificar directamente la función genética es difícil.
En la edición genética bacteriana habitual, Cas9 corta ambas hebras del ADN objetivo y el proceso de reparación celular induce mutaciones genéticas. Sin embargo, la mayoría de las leptospiras no pueden reparar adecuadamente los cortes de doble hebra (DSB). Aunque Cas9 corte con precisión, las células editadas no sobreviven, dificultando la recuperación de cepas knockout. La técnica de interferencia CRISPR con Cas9 inactiva la transcripción pero no altera permanentemente la secuencia genética.
El equipo desarrolló un sistema combinado de CRISPR/Cas9-uniendo extremos no homólogos (NHEJ) y edición primaria (PE) de CRISPR. El primero complementa la capacidad de reparación y el segundo evita los cortes mortales.
Hallazgo clave
En el sistema CRISPR/Cas9-NHEJ, se expresan conjuntamente Cas9, ARN guía y proteínas de reparación LigD y Ku de Mycobacterium smegmatis. Ku agarra los extremos cortados y LigD los une, proporcionando la capacidad de NHEJ que le falta a Leptospira. Esta reparación inexacta genera inserciones o eliminaciones (indel) que alteran el marco de lectura genético, permitiendo crear mutantes knockout.
La edición primaria reduce riesgos y aumenta precisión. Los investigadores fusionaron Cas9-nicaza con una transcriptasa inversa. El ARN guía de edición primaria dirige la secuencia objetivo y la transcriptasa inversa registra la secuencia deseada en el ADN. Al no cortar ambas hebras, se preserva la viabilidad celular en leptospiras sensibles a DSB.
Los sistemas tienen funciones claramente diferenciadas. Cas9-NHEJ es adecuado para generar rápidamente múltiples indel mediante reparación defectuosa. PE, en cambio, es ideal para experimentos que requieren resultados predefinidos, como sustituciones de un solo nucleótido. Ahora se puede elegir entre destrucción genética y corrección precisa según el objetivo, superando métodos anteriores basados en mutaciones aleatorias o supresión temporal.
Significado y perspectivas
El nuevo sistema edita genéticamente a Leptospira para validar causalmente factores patogénicos, rutas metabólicas, genes de supervivencia ambiental y colonización. Comparando cepas con genes eliminados y con cambios específicos, se pueden analizar efectos de pérdida de proteínas y cambios individuales de aminoácidos. También es útil para estudiar diferencias funcionales entre especies y serotipos.
En el desarrollo de vacunas, se pueden aplicar cepas atenuadas al eliminar genes patogénicos o ajustar la producción de antígenos. Sin embargo, los resultados actuales se centran en el desarrollo de herramientas. La eficiencia de edición por objetivo, mutaciones no objetivo, variaciones en la transferencia y expresión de plásmidos según la cepa, y la variabilidad de los indel generados por NHEJ requieren validación adicional. PE también depende de la secuencia cercana al objetivo y del diseño del ARN guía. Para evaluar el uso real, se debe confirmar la estabilidad genética y la patogenicidad en modelos de infección animal.
La manipulación genética de especies de Leptospira ha avanzado significativamente en los últimos años. Al igual que la mayoría de los procariotas, las leptospiras no pueden sobrevivir a los cortes de doble hebra (DSB) inducidos por la endonucleasa Cas9, lo que ha motivado el desarrollo de estrategias alternativas para la eliminación genética. Hemos establecido dos sistemas para la mutagénesis dirigida en especies de Leptospira: CRISPR/Cas9-NHEJ y edición primaria de CRISPR (PE). El enfoque CRISPR/Cas9-NHEJ implica la coexpresión del mecanismo CRISPR/Cas9 junto con las proteínas de reparación de ADN LigD y Ku de Mycobacterium smegmatis, facilitando una reparación defectuosa de DSB que genera mutaciones de inserción o eliminación (indel). En contraste, la edición primaria de CRISPR es una estrategia sin DSB que utiliza una Cas9-nicaza fusionada a una transcriptasa inversa que permite ediciones precisas de un solo nucleótido en el genoma. Esta expansión de herramientas coloca a las especies de Leptospira en la vanguardia de la manipulación genética bacteriana.
En el laboratorio, se pueden eliminar genes patogénicos sospechosos con Cas9-NHEJ para seleccionar fenotipos de infección y luego usar PE para cambiar bases o aminoácidos específicos y delimitar mecanismos. Por ejemplo, al inocular cepas editadas en modelos de infección en hámsteres y comparar su capacidad de causar enfermedad aguda y colonizar riñones, se puede identificar el rol de los genes en etapas específicas de la infección.
En el ámbito industrial, diseñar cepas vacunales sin genes tóxicos es una aplicación prometedora. Sin embargo, se deben evaluar la estabilidad en cultivos, mutaciones no objetivo y riesgos de liberación ambiental. Al manipular con precisión patógenos, también se deben establecer normas de bioseguridad y regulaciones adecuadas.