Nuevas pruebas de que la MEC puede actuar como barrera para la terapia génica con AAV
La MEC como barrera para la terapia génica
Un estudio in vitro halló que la matriz extracelular (MEC) puede limitar la difusión de vectores de virus adenoasociados (AAV) y la transducción génica. El efecto varió según el serotipo de AAV y el tejido del que procedía la MEC. El estudio no evaluó los resultados del tratamiento en pacientes ni probó formas de superar esta barrera de entrega de los vectores.
En la terapia génica basada en AAV, los vectores deben llegar a las células diana. La MEC, que forma parte del microambiente tisular, puede obstaculizar físicamente el movimiento de las partículas o unirse a ellas y limitar así su llegada a las células. El equipo investigó cómo influyen en la difusión y la transducción génica la composición de la MEC específica de cada tejido y el serotipo de AAV.
La difusión y la transducción génica varían según el AAV y el tejido
El equipo marcó con fluorescencia AAV2, AAV6 y AAV8, y siguió su difusión mediante imágenes en hidrogeles de matriz extracelular descelularizada (dMEC) obtenida de pulmón, hígado y submucosa del intestino delgado de cerdo. Como comparación se utilizaron nanopartículas de tamaño similar, de 20 nm, recubiertas de polietilenglicol (PEG).
AAV6 y AAV8 se difundieron significativamente más despacio que las nanopartículas de comparación en la dMEC de los tres tejidos. AAV2 se difundió significativamente más despacio en la dMEC de pulmón e hígado, pero no mostró una diferencia significativa frente a las nanopartículas en la dMEC de la submucosa del intestino delgado. De los tres serotipos, AAV2 fue el que se difundió más rápido; el orden relativo de AAV6 y AAV8 varió según el tejido.
La transducción génica se evaluó en cultivos bidimensionales y modelos tridimensionales de esferoides de células A549. En cultivos 2D cubiertos con dMEC pulmonar a una concentración de 6 mg/mL, se midió a las 48 horas la proporción de células positivas para la proteína verde fluorescente (GFP). Con AAV2 y AAV6, esta proporción cayó aproximadamente a la mitad del nivel observado sin dMEC. No se observó la misma reducción con AAV8. Sin embargo, incluso sin dMEC, AAV8 produjo una proporción menor de células positivas para GFP que los otros dos serotipos.
Hay que distinguir la proporción de células transducidas de la intensidad de fluorescencia de GFP por célula. En presencia de dMEC pulmonar, la intensidad de fluorescencia de GFP en las células viables disminuyó con AAV6, pero aumentó con AAV2 y AAV8. En el experimento con AAV6 y esferoides tridimensionales rodeados de dMEC pulmonar, disminuyeron tanto la proporción de células transducidas entre las células viables como la intensidad de fluorescencia de GFP por célula. Estos resultados no pueden generalizarse a la respuesta de los tres serotipos en condiciones tridimensionales.
Evaluación de vectores teniendo en cuenta la MEC y preguntas pendientes
Los resultados aportan una base para considerar las interacciones con la MEC al diseñar AAV de nueva generación. A partir de la diferencia observada frente a nanopartículas de tamaño similar, los investigadores interpretaron que la unión a la MEC podría explicar parcialmente la reducción de la difusión. No determinaron directamente la cantidad de unión a componentes específicos de la MEC ni una relación causal entre la menor difusión y la reducción de la transducción génica.
El hidrogel de dMEC es un modelo para comparar diferencias de composición entre tejidos, pero no reproduce fielmente la estructura del tejido vivo. La viabilidad celular también disminuyó en la condición tridimensional con dMEC, y sigue abierta la posibilidad de que cambios en las características celulares debidos a las interacciones entre células y MEC afectaran a la transducción génica. Como línea de investigación futura, se propuso modificar la cápside, la estructura proteica que forma la cubierta externa del virus, para reducir la unión a la MEC. Este estudio no evaluó si era posible superar la barrera o mejorar los resultados del tratamiento en pacientes.
Fuente: Estudio original, DOI del artículo.
PURPOSE: The extracellular matrix (ECM) is a major component of the tissue microenvironment which may pose a barrier to the distribution of AAV in target organs, preventing delivery of therapeutic cargo. We sought to address this potential barrier to AAV gene therapy by furthering our understanding of AAV-ECM interactions. We hypothesized that both the AAV serotype and ECM composition will impact AAV transport and gene delivery. METHODS: AAV2, AAV6, and AAV8 viral vectors were fluorescently labeled to allow for visualization of their diffusion through the ECM. Lung, liver, and small intestinal submucosal dECM hydrogels were formulated as models of the ECM with tissue-specific biomolecular content. We then characterized AAV and nanoparticle diffusion within decellularized ECM using fluorescent video microscopy and multiple particle tracking. Additionally, we evaluated AAV transduction in dECM-incorporated 2D and 3D spheroid tissue culture models. RESULTS: All AAV displayed reduced diffusivity through ECM as compared to similarly sized nanoparticles. AAV2 diffusion was least affected by the presence of ECM across tissue types as compared to AAV6 and AAV8. AAV transduction in dECM incorporated CONCLUSIONS: These results suggest binding of AAV to the ECM may decrease their therapeutic effect in target tissues throughout the body. The barrier function of the ECM should be considered in development of AAV for gene therapy applications.
El estudio aporta una base para comparar candidatos AAV tanto en condiciones con células solamente como en condiciones que incluyen MEC procedente del tejido diana. Por ejemplo, al probar un vector dirigido al pulmón, un diseño de evaluación podría medir por separado la difusión en dMEC pulmonar, la proporción de células transducidas y la intensidad de fluorescencia de GFP por célula. En este estudio, estas medidas no siempre cambiaron en la misma dirección. Por eso, una difusión más lenta por sí sola dificulta valorar de manera uniforme la transducción génica o los patrones de expresión. Sin embargo, estos resultados in vitro por sí solos no permiten determinar qué serotipo sería adecuado para pacientes ni predecir una mejora de la eficacia clínica.