Guía práctica para la corrección genómica precisa mediante edición directa e inversa de primers
Antecedentes
La edición mediante primers (prime editing, PE) es una técnica de edición precisa que registra en el genoma las sustituciones, inserciones y eliminaciones deseadas sin cortar el ADN de doble hebra. A diferencia del CRISPR-Cas9 tradicional, que corta el ADN objetivo, PE utiliza una fusión de Cas9 nickase y una transcriptasa inversa modificada del virus de leucemia murina de Moloney (MLV-RT). Junto con esto, una guía de edición de primers (pegRNA) especifica tanto la ubicación de edición como la secuencia a sintetizar.
La pegRNA incluye no solo la secuencia guía para identificar el objetivo, sino también un sitio de unión de cebador (PBS) y una plantilla para la transcriptasa inversa (RTT). Gracias a este diseño, se pueden introducir mutaciones puntuales y eliminaciones o inserciones relativamente cortas sin necesidad de ADN donante externo. Sin embargo, en la práctica experimental, los resultados varían significativamente según el tipo de editor, la longitud de PBS y RTT, y las condiciones de transfección celular. Predecir cuál diseño de pegRNA funcionará entre los candidatos tampoco es sencillo. Aunque han surgido diversas variantes de PE y estrategias de corte de hebras complementarias, no existían hasta ahora instrucciones consistentes que permitan a investigadores con poca experiencia en edición genómica aplicar estos métodos de manera sistemática.
Hallazgo clave
El equipo de investigación propuso un protocolo práctico para realizar edición directa de primers y edición inversa de primers (iPE) en células cultivadas y validar los resultados. Ambos métodos utilizan la transcriptasa inversa y la pegRNA, pero difieren en la dirección de síntesis del ADN. En la PE convencional, la plantilla RTT es complementaria a la hebra no objetivo, y la nueva hebra se sintetiza desde el extremo 3′ expuesto. En cambio, en la iPE, la plantilla de ARN es complementaria a la hebra objetivo, extendiendo esta última en dirección opuesta.
Esta diferencia no se limita a un cambio en la dirección de la reacción. Debido a la ubicación o estructura de la secuencia PAM (protospacer adjacent motif) cercana al objetivo, la PE directa puede resultar difícil, y en esos casos, la iPE ofrece una vía alternativa. Los investigadores organizaron criterios para elegir el editor según la mutación puntual deseada, así como para insertar o eliminar secuencias pequeñas o medianas, y para diseñar la PBS y RTT de la pegRNA. Un aspecto destacado del protocolo es que, en lugar de depender de un diseño único, se recomienda crear varios candidatos y compararlos directamente en células.
También se abordó el método para evaluar los resultados de edición. La edición de reporteros con señales fluorescentes se mide por citometría de flujo para evaluar la eficiencia a nivel celular. En el genoma real, se utiliza la secuenciación de nueva generación (NGS) para determinar la proporción de mutaciones deseadas y distinguir los subproductos no deseados, como inserciones o eliminaciones no planeadas. Se integró un procedimiento desde la introducción del editor hasta la evaluación cuantitativa, enfocándose en un diseño experimental reproducible más que en una explicación teórica simple.
Significado y perspectivas
Este protocolo puede servir como punto de partida para que los investigadores elijan entre PE y iPE según las limitaciones de la secuencia objetivo, diseñen y seleccionen candidatos de pegRNA. Se puede aplicar para reproducir mutaciones puntuales asociadas a enfermedades en células, o para revertir mutaciones existentes y crear modelos homocigóticos. También tiene potencial para insertar etiquetas proteicas o analizar secuencias reguladoras mediante inserciones o eliminaciones.
Sin embargo, un protocolo de laboratorio no equivale inmediatamente a una tecnología terapéutica. La eficiencia de edición depende del tipo celular, la ubicación del objetivo y el entorno de reparación del ADN, y no siempre se puede juzgar la precisión genómica solo con resultados de citometría de flujo. Aunque la NGS puede detectar subproductos, se requieren análisis adicionales para identificar cambios off-target lejanos, grandes reorganizaciones genómicas o alteraciones funcionales celulares a largo plazo. En el futuro, será necesario optimizar según el tipo celular, desarrollar vectores de entrega y verificar más ampliamente la seguridad. La posibilidad de comparar la edición directa e inversa en el mismo sistema experimental ampliará la base para futuras optimizaciones.
La edición mediante primers (PE) es un método poderoso para introducir mutaciones puntuales en los genomas de organismos vivos. La PE utiliza una Cas9 nickasa fusionada a una transcriptasa inversa modificada del virus de leucemia murina de Moloney (MLV-RT), emparejada con una guía de ARN extendida conocida como pegRNA, que contiene un sitio de unión de cebador (PBS) y una plantilla para la transcriptasa inversa (RTT) complementaria al ADN de la hebra no objetivo. Recientemente se describió la edición inversa mediante primers (iPE), que también emplea transcriptasa inversa y pegRNAs; sin embargo, utiliza una plantilla de ARN complementaria a la hebra objetivo, lo que resulta en la polimerización de la hebra objetivo en dirección opuesta. En este trabajo, proporcionamos un protocolo práctico para utilizar PE o iPE para introducir mutaciones puntuales o inserciones y eliminaciones de tamaño pequeño a mediano en cultivo celular, y demostramos cómo evaluar la eficiencia de edición mediante citometría de flujo y secuenciación de nueva generación. Incluimos recomendaciones para la selección de editores de primers y directrices sencillas para el diseño de pegRNA, destinadas a investigadores no familiarizados con las tecnologías de edición genómica.
Las empresas farmacéuticas y de modelos de enfermedad pueden reproducir mutaciones puntuales encontradas en pacientes en células normales, y comparar la respuesta a medicamentos antes y después de la corrección. Por ejemplo, en objetivos donde no hay PAM adecuado para la PE directa, se pueden diseñar candidatos de iPE, seleccionarlos inicialmente con reporteros fluorescentes y luego determinar la tasa de corrección precisa y los subproductos mediante NGS. Este procedimiento podría reducir el tiempo necesario para validar los mecanismos de acción de candidatos terapéuticos y construir modelos celulares para medicina de precisión. Sin embargo, en etapas de fabricación clínica, se deben verificar por separado la eficiencia de entrega, los efectos off-target, las reorganizaciones genómicas grandes y la función celular tras cultivos prolongados.