La vacuna de ARNm dirigida contra la proteína GP5 mostró potencial para combatir el síndrome respiratorio y reproductivo porcino
Antecedentes
El síndrome de reproducción y enfermedad respiratoria porcina (PRRSV) provoca trastornos reproductivos en las cerdas madres y enfermedades respiratorias en los lechones, lo que genera pérdidas enormes para la industria porcina. La razón principal por la que es difícil controlar su propagación es la alta diversidad genética del virus. A medida que surgen continuamente variantes en diferentes regiones y granjas, estas pueden eludir la inmunidad inducida por las vacunas existentes.
Las vacunas vivas atenuadas utilizadas actualmente inducen una respuesta inmunitaria relativamente fuerte, pero su capacidad para bloquear cepas virales heterólogas no es constante y se ha planteado la posibilidad, aunque rara, de recuperación de la patogenicidad y recombinación. Las vacunas inactivadas son seguras, pero pueden no generar una respuesta suficiente de inmunidad celular y anticuerpos neutralizantes. Los investigadores se centraron en la plataforma de ácido mensajero ribonucleico (ARNm), que permite cambiar rápidamente el diseño del antígeno sin administrar el propio virus. Como diana, eligieron la glicoproteína GP5, una proteína principal de la envoltura del PRRSV que incluye el sitio de unión de los anticuerpos neutralizantes.
Hallazgos clave
Los investigadores amplificaron el gen ORF5 completo de la cepa HeN-HC del PRRSV altamente patógeno, lo insertaron en el vector pIVT5 y construyeron el plásmido recombinante pIVT5-GP5. Utilizando esto como molde, sintetizaron GP5-mRNA mediante transcripción in vitro y lo encapsularon en nanopartículas lipídicas (LNP). El tamaño principal de las partículas completadas fue de aproximadamente 135 nanómetros y el potencial zeta fue de aproximadamente -25 milivoltios.
Se confirmó si el ARNm se traduce en antígeno real utilizando células Marc-145 de origen renal de mono. En la inmunofluorescencia indirecta, se observó fluorescencia específica en las células inyectadas con GP5-mRNA, y en el Western blot se detectó una banda de proteína GP5 de aproximadamente 25 kilodaltons. Esto constituye evidencia de que el ARNm diseñado produce la proteína objetivo dentro de la célula.
La evaluación de la inmunogenicidad se llevó a cabo dividiendo 60 ratones BALB/c SPF (libres de patógenos específicos) de 6 semanas de edad en tres grupos: grupo ARNm GP5-LNP, grupo de vacuna viva atenuada comercial y grupo control con medio. Los investigadores administraron inyecciones intramusculares en los días 0, 14 y 28, y se extrajo suero en los días 14, 28, 35 y 42. Los niveles de inmunoglobulina G (IgG) específicos fueron más altos que en el grupo control, y se detectó actividad neutralizante contra la cepa HeN-HC homóloga desde el día 28 post-vacunación hasta el día 42.
En el análisis de células plasmáticas del día 42, las células T CD3 positivas y CD4 positivas fueron del 9.59% en el grupo de la vacuna de ARNm y del 0.96% en el grupo control con medio. Las células T CD3 positivas y CD8 positivas también fueron del 14.3% y del 0.28%, respectivamente. Las proporciones correspondientes en el grupo de la vacuna comercial fueron del 5.73% y del 6.39%. Las células esplénicas estimuladas con el antígeno secretaron interleucina-2, interferón gamma e interleucina-4; en particular, la respuesta del interferón gamma fue mayor que la del grupo de vacunas comerciales. Esto respalda la interpretación de que se indujeron tanto la inmunidad humoral como la celular.
Significado y perspectivas
Estos resultados muestran la posibilidad de que el ARNm-LNP que codifica únicamente el antígeno GP5 pueda inducir simultáneamente una respuesta de anticuerpos de unión, actividad neutralizante y respuestas de células T citotóxicas auxiliares. Otra ventaja es que es posible rediseñar rápidamente candidatos dirigidos a variantes epidémicas mediante la sustitución de secuencias de bases, sin necesidad de procesos de cultivo viral. También existe la posibilidad de ampliar esta estrategia mediante la combinación de múltiples variantes del GP5 para crear una vacuna multivalente, o incluyendo otras proteínas estructurales.
No obstante, esta investigación se limita a una evaluación preliminar de inmunogenicidad. Los ratones no son el huésped natural del PRRSV y tampoco se realizó la inoculación viral, por lo que es desconocido si hubo una inhibición real de la enfermedad y una reducción de la viremia. La prueba de neutralización también se limitó a la cepa HeN-HC, que coincide con el antígeno vacunal. En los cerdos, deben verificarse la dosis adecuada, el intervalo de vacunación, la duración de la inmunidad, la capacidad de protección contra cepas heterólogas y la seguridad del LNP. En particular, dado que GP5 presenta muchas variantes y puede inducir anticuerpos neutralizantes dominantes en la inmunidad, la adición de antígenos conservados y la optimización de la combinación de antígenos son claves para el desarrollo posterior.
Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) remains a major threat to the global swine industry, and the continuous emergence of genetically diverse strains poses challenges to vaccine development. En este estudio, se construyó una vacuna de ARNm formulada en nanopartículas lipídicas que codifica la proteína GP5 del PRRSV y se evaluó su inmunogenicidad preliminar en ratones BALB/c. The full-length ORF5 gene was amplified and cloned into the pIVT5 vector to generate the recombinant plasmid pIVT5-GP5. GP5-mRNA was synthesized via in vitro transcription and transfected into Marc-145 cells to verify antigen expression. El ensayo de inmunofluorescencia indirecta mostró señales de fluorescencia específicas en células transfectadas con ARNm de GP5, y el Western blot confirmó adicionalmente la expresión de la proteína GP5. The GP5-mRNA was subsequently encapsulated into lipid nanoparticles to prepare the GP5 mRNA-LNP vaccine formulation. BALB/c mice were immunized intramuscularly to evaluate humoral and cellular immune responses. The GP5 mRNA-LNP vaccine induced a GP5-specific IgG response, and sera collected on days 28, 35, and 42 after the initial immunization showed detectable neutralizing activity against PRRSV. El análisis citométrico de flujo mostró una proporción aumentada de CD3+
Si se comercializa, podría conducir a un sistema de vacunas personalizado por región en el que se analice la secuencia genética del virus circulante en la granja y luego se produzca rápidamente el ARNm de GP5 correspondiente. En las granjas reproductoras o complejos porcinos a gran escala, también existe la posibilidad de que se utilice como un agente de vacunación adicional no replicante para reducir los riesgos de recombinación y persistencia asociados con las vacinas vivas atenuadas tradicionales. Mantener el mismo proceso de fabricación de LNP permite cambiar únicamente la secuencia antigénica, lo que también es ventajoso para el desarrollo y la transición de producción de vacunas multivalentes.
Sin embargo, aún es prematuro discutir la aplicación en granjas. Deben confirmarse las lesiones pulmonares, la viremia, el aumento de peso y los resultados reproductivos mediante pruebas de vacunación de desafío en lechones destetados y cerdas preñadas, y también deben compararse directamente con vacunas comerciales los costos de producción a gran escala y la estabilidad durante la distribución en frío.