Nanopartículas de ARNm de CCDC40 mejoran la función ciliar en células de vías respiratorias derivadas de pacientes y en peces cebra
Evaluación de la recuperación ciliar al reponer la proteína ausente
La administración de ARN mensajero (ARNm) que codifica CCDC40, encapsulado en nanopartículas lipidoides (LNP), mejoró la función ciliar en células de las vías respiratorias derivadas de pacientes y en peces cebra con deficiencia de CCDC40. La localización de las proteínas se recuperó en algunas células, y los resultados en animales variaron según la vía de administración. El estudio evaluó cambios funcionales en células cultivadas y animales; no fue un ensayo clínico que midiera la función respiratoria de pacientes.
La discinesia ciliar primaria (DCP) es una enfermedad genética en la que el movimiento ciliar alterado reduce la capacidad de las vías respiratorias para eliminar moco y patógenos. Las infecciones respiratorias recurrentes pueden causar bronquiectasias e insuficiencia respiratoria crónica, y las variantes patogénicas de CCDC40 se asocian con un deterioro más grave de la función pulmonar que varios otros genotipos. El artículo señala que los tratamientos actuales se centran en el control de los síntomas, incluido el manejo de las infecciones y la eliminación de secreciones, y que todavía no existe un tratamiento que corrija el defecto subyacente.
CCDC40 ayuda a que las proteínas asociadas se localicen en el axonema, el armazón interno de los cilios. El equipo probó una estrategia que suministra ARNm para que las células produzcan la proteína necesaria.
Mejoras del batido y del transporte local de partículas en células derivadas de pacientes
El equipo cultivó células del epitelio respiratorio nasal de cinco pacientes con variantes patogénicas en ambos alelos de CCDC40, en una interfaz aire-líquido. Con vistas a una futura administración inhalada, aplicó LNP-CCDC40-mRNA a la superficie apical del epitelio cultivado una vez por semana durante seis semanas.
Tras cuatro administraciones, la frecuencia de batido ciliar en las células derivadas de pacientes fue de 3,25 ± 0,08 Hz en el grupo de ARNm de control y de 9,48 ± 0,22 Hz en el grupo de ARNm de CCDC40. En células de seis donantes sanos fue de 8,98 ± 0,08 Hz; no hubo una diferencia estadísticamente significativa entre el grupo de ARNm de CCDC40 y los controles sanos. También se observó una mejora del batido tras seis administraciones, junto con una mejora del transporte de partículas fluorescentes. Sin embargo, el desplazamiento de partículas correspondió al transporte local dentro del campo observado y no significa que se restableciera el aclaramiento mucociliar en toda la superficie de cultivo.
En las células cultivadas de cuatro donantes en las que fue posible realizar análisis por inmunofluorescencia, se observó que CCDC40 y las proteínas asociadas CCDC39, GAS8/DRC4 y DNALI1 volvían a localizarse en el axonema. La recuperación de la localización axonemal de CCDC40 se observó en el 10–74 % de las células multiciliadas, con una media del 31,5 %, lo que muestra una amplia variación entre donantes. El denominador fue el número de células multiciliadas analizadas; este porcentaje no representa la eficiencia de entrega a todas las células de las vías respiratorias ni la tasa de éxito terapéutico en pacientes. La ultraestructura posterior al tratamiento no se evaluó mediante microscopía electrónica, por lo que no se confirmó la reconstrucción completa de la estructura interna.
Resultados dependientes de la vía en animales y necesidad de validación clínica
En peces cebra con deficiencia de CCDC40, los investigadores probaron la inyección en embriones en estadio unicelular y la exposición de larvas a un medio de cultivo con el fármaco a partir de las 30 horas tras la fecundación. La exposición al medio no se limitó a las fosas olfatorias, y la inyección tampoco se realizó directamente en ellas. A los cinco días después de la fecundación, en el grupo de embriones inyectados, la frecuencia de batido ciliar y la velocidad de transporte de partículas en las fosas olfatorias se aproximaron a los niveles de tipo silvestre, y mejoró la direccionalidad del flujo.
En cambio, los grupos expuestos al medio a 10 ng/μL y 160 ng/μL no mostraron diferencias significativas en la frecuencia de batido frente al grupo deficiente no tratado. A la concentración más alta, 160 ng/μL, mejoraron el área con batido ciliar y la velocidad de transporte de partículas, pero la recuperación de la direccionalidad del flujo fue parcial. Como los resultados variaron según el método de administración, es difícil generalizar los efectos de la inyección embrionaria a un tratamiento inhalado en humanos.
Este estudio es una prueba de concepto preclínica de que reponer una proteína deficiente puede mejorar la función ciliar. Se utilizaron células de un número reducido de donantes y el grado de recuperación también varió. Los investigadores indicaron en el artículo que planean un ensayo de fase 1 en personas portadoras de variantes patogénicas de CCDC40. El estudio no informó que el ensayo clínico hubiera comenzado ni presentó resultados que demostraran la seguridad o la eficacia en humanos.
Fuente: Texto completo del artículo de American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology, DOI: 10.1093/ajrcmb/aanag034.
Primary Ciliary Dyskinesia (PCD) is a genetically heterogeneous disorder leading to destructive airway disease with severe bronchiectasis and chronic lung failure in adulthood. Pathogenic variants in CCDC40 are associated with more severe reduction of lung function compared to most other PCD types. Currently, no therapies correcting the underlying disease mechanism are available. Here we investigate the efficacy of lipidoid nanoparticle-formulated mRNA encoding human CCDC40 (LNP-CCDC40-mRNA) as a corrective measure for structural and functional defects in vitro (human cells) and in vivo (zebrafish). Human nasal respiratory epithelial cells cultured at air-liquid-interface from five CCDC40-deficient individuals and a newly generated vertebrate animal model (ccdc40-/- zebrafish) were treated with LNP-CCDC40-mRNA. CCDC40-deficient cells were analyzed by high-speed video microscopy and immunofluorescence microscopy. ccdc40-/- zebrafish olfactory pit cilia were analyzed by high-speed video microscopy and fluid flow assays. Topical application of exogenous LNP-CCDC40-mRNA to CCDC40-deficient cells results in endogenous CCDC40 expression (10-74% of ciliated cells), enabling axonemal integration of CCDC40-associated proteins (CCDC39, GAS8/DRC4, DNALI1). Consistently, ciliary beat frequencies were significantly increased in treated CCDC40-deficient cells and comparable to healthy control cells. Further, we showed improved ciliary transport of fluorescent particles. Injection or topical application of human LNP-CCDC40-mRNA to ccdc40-/- zebrafish significantly increased ciliary motility and established directional flow in olfactory pits. We provide structural and functional evidence in vitro and in vivo for the biological efficacy of LNP-CCDC40-mRNA in CCDC40-deficient respiratory cells and zebrafish. Based on our results, an in vivo human study (Phase 1 trial) is planned in individuals with pathogenic variants in CCDC40.
El estudio aporta una justificación para desarrollar un candidato terapéutico inhalado que reponga la proteína ausente en la discinesia ciliar primaria asociada a variantes de CCDC40. Un caso concreto de uso consiste en aplicar una formulación candidata a células de las vías respiratorias derivadas de pacientes y evaluar conjuntamente la localización de proteínas en el axonema, el batido ciliar y el transporte de partículas. Medir por separado la frecuencia de batido y el transporte de partículas permite delimitar mejor el alcance de la mejora funcional. Para que llegue a ser un tratamiento, habrá que determinar si alcanza las vías respiratorias humanas en cantidad suficiente, si la administración repetida es segura, cuánto dura el efecto y si se traduce en una mejora de la función pulmonar. La extensión a otros genotipos de DCP también requerirá validar por separado las formulaciones específicas para cada gen y su capacidad de entrega.