CRISPR-Cas13d redujo a menos del 5% la viabilidad de células cultivadas de melanoma uveal
Un estudio de melanoma uveal dirigido al ARN en vez de al ADN
Al dirigir CRISPR-Cas13d contra el ARN de RASGRP3, la viabilidad de las tres líneas celulares humanas de melanoma uveal cultivadas cayó por debajo del 5% a las 48 horas del tratamiento. El equipo investigador administró conjuntamente el ARNm de Cas13d y el ARN guía en nanopartículas lipídicas (LNP). Estos resultados constituyen una prueba de concepto demostrada en cultivo celular. No se evaluó la eliminación de tumores ni la conservación de la visión en animales o pacientes. El estudio se publicó en la revista Molecular Therapy Oncology.
El melanoma uveal se origina en los melanocitos del iris, el cuerpo ciliar y la coroides, y es el tumor maligno intraocular primario más frecuente en adultos. Los tratamientos locales incluyen radioterapia y cirugía, pero las opciones terapéuticas para la enfermedad metastásica son limitadas. Para actuar sobre proteínas intracelulares difíciles de abordar con los fármacos existentes, el equipo probó una estrategia que degrada el ARN que codifica esas proteínas.
Se aprovecharon tanto la dependencia de las células cancerosas como la alta expresión
Los investigadores analizaron datos de inactivación génica mediante CRISPR de DepMap, que incluyen más de 1.000 líneas celulares cancerosas, junto con datos de expresión de TCGA y GTEx, y seleccionaron RASGRP3 como candidato. Este gen presentaba una expresión alta en el melanoma uveal, cuyas células mostraban una dependencia selectiva de él para sobrevivir. La proteína RasGRP3 ayuda a transmitir la señalización RAS–MAPK, que participa en la proliferación de las células cancerosas, pero es difícil de abordar con los métodos existentes porque se encuentra dentro de las células y carece de un sitio claro de unión a fármacos.
Cas13d es una enzima que corta el ARN indicado por un ARN guía. El equipo probó 42 guías dirigidas a RASGRP3 y seleccionó g4. Por separado, comparó la eficiencia de entrega de 30 formulaciones de LNP mediante ARNm que codifica la proteína fluorescente GFP y luego encapsuló conjuntamente el ARNm de Cas13d y g4 en la formulación de LNP seleccionada. La formulación final se diseñó para actuar a nivel del ARN, en lugar de editar permanentemente el ADN.
A las 48 horas, las respuestas divergieron entre las líneas cancerosas y las de control
Tras el tratamiento con Cas13d-LNP, la viabilidad media medida por citometría de flujo fue del 4,73% en la línea de melanoma uveal 92-1, del 3,90% en MP-41 y del 2,80% en MP-46. Las líneas celulares de control HEK293T y HeLa, que no son de melanoma uveal, presentaron viabilidades del 86,33% y el 84,34%, respectivamente; el modelo no canceroso de epitelio pigmentario de la retina ARPE-19 presentó una viabilidad del 90,73%. La viabilidad de las líneas de control fue similar a la de los controles sin tratar. Sin embargo, entre los controles también había líneas celulares derivadas de otros cánceres, por lo que estos resultados no pueden generalizarse como evidencia de seguridad en los tejidos normales en general.
En un experimento comparativo independiente con células 92-1, Cas13d redujo la viabilidad más que la inactivación génica con Cas9 y la supresión con siRNA. Sin embargo, los métodos de administración y los momentos de evaluación fueron distintos, y los investigadores señalaron que el Cas9 y el siRNA utilizados en la comparación podrían no haber estado optimizados. Es difícil interpretar el resultado como prueba de una superioridad general frente a otras tecnologías.
La supresión de la diana y la degradación colateral del ARN actuaron conjuntamente
Los investigadores interpretaron que tanto la disminución del ARNm de RASGRP3 como el «corte colateral del ARN» contribuyeron al efecto de muerte celular. Después de cortar el abundante ARN diana, Cas13d también puede degradar ARN distinto del ARN diana. A las 12 horas del tratamiento, el ARN de GAPDH, que no era la diana, también disminuyó de forma marcada en algunas líneas celulares cancerosas, pero apenas cambió en ARPE-19.
En un experimento de rescate, los investigadores añadieron una copia de RASGRP3 que codifica la misma proteína pero que la guía no reconoce. La viabilidad se recuperó parcialmente, de alrededor del 3% a alrededor del 46%. Esto respalda la interpretación de que la degradación colateral del ARN también contribuye a la muerte celular, además de la supresión del gen diana.
Los estudios posteriores deberán examinar las diferencias en la expresión de RASGRP3 entre tumores, la resistencia por evasión del reconocimiento de la diana, la distribución en el organismo y las respuestas inmunitarias ante dosis repetidas. También queda por comprobar la entrega al ojo o a los focos de metástasis hepática. El diseño y los resultados del estudio pueden consultarse en el texto completo del artículo y en el registro bibliográfico y del resumen.
Uveal melanoma, the most common eye cancer in adults, remains limited to surgical intervention and radiotherapy, with a dismal survival rate that has not improved in over 50 years. To address this therapeutic impasse, we systematically analyzed public gene expression and CRISPR knockout datasets, identifying
Este estudio mostró, en un modelo celular de melanoma uveal, una estrategia para actuar a nivel del ARN sobre una proteína a la que los fármacos se unen con dificultad. En particular, aprovechó tanto la dependencia génica de las células cancerosas como la abundancia del ARN diana para utilizar la degradación colateral del ARN por Cas13d con un efecto anticanceroso. El proceso integrado, desde la identificación de la diana hasta la selección de guías y la optimización del vehículo de administración, también ofrece un marco de investigación para probar otras dianas cancerosas. Sin embargo, el valor de esta estrategia depende de que su potente efecto de muerte celular y su selectividad se mantengan en el complejo entorno de un organismo. Para evaluar la viabilidad del desarrollo clínico, habrá que verificar la eficacia, la toxicidad tisular y la factibilidad de la entrega en células primarias, modelos tumorales con expresión heterogénea de la diana y animales.