Twin Prime Editing Swap-seq revela los mecanismos de control de potenciadores y silenciadores en el genoma no codificante
Antecedentes
La región no codificante, que constituye el 98% del genoma humano, es un regulador clave que gobierna la expresión génica. Esta área contiene diversas secuencias reguladoras, como potenciadores (enhancers) que promueven la transcripción, silenciadores (silencers) que la inhiben y aisladores (insulators) que compartimentan la estructura tridimensional de la cromatina. La mayoría de las variantes genéticas asociadas a enfermedades se encuentran en regiones no codificantes. Sin embargo, determinar el impacto cuantitativo de cada elemento regulador en la expresión del gen objetivo ha sido un desafío persistente.
Los investigadores han dependido principalmente del ensayo de reportero masivo paralelo (MPRA). No obstante, los plásmidos exógenos presentan limitaciones claras al no reflejar la estructura de plegamiento 3D de la cromatina real ni el entorno epigenético. Posteriormente, se introdujo el cribado mediante interferencia CRISPR (CRISPRi), pero la difusión de la señal de inhibición dificultó la medición precisa de los efectos individuales de cada elemento. Por ello, se requería una nueva plataforma capaz de realizar escisiones precisas de múltiples elementos reguladores en su contexto cromatínico nativo y rastrear los cambios en la expresión.
Hallazgos clave
El equipo de investigación liderado por el profesor Jesse Engreitz de la Universidad de Stanford ha desarrollado 'Swap-seq', una plataforma de cribado a gran escala que combina la edición twin prime (twinPE) con citometría de flujo. La estrategia aplica twinPE, que utiliza una combinación de dos ARN guía de edición prime (pegRNA) para eliminar cientos de pares de bases sin causar rupturas de doble cadena. El equipo eliminó cientos de secuencias reguladoras candidatas en el genoma endógeno de una línea celular de monocitos humanos (THP-1). Posteriormente, se separaron las células mediante clasificación activada por fluorescencia (FACS) y se cuantificó el efecto de la deleción mediante secuenciación.
Como primer objetivo, se analizó la localización del gen de la enzima isomerasa cis-trans de prolil-petidilo F (peptidyl-prolyl cis-trans isomerase F, PPIF). Se logró medir con precisión la actividad cuantitativa de los potenciadores internos y distales en las regiones cercanas a PPIF. El factor de unión a CCCTC (CCCTC-binding factor, CTCF), que forma la estructura tridimensional de la cromatina, también delimita claramente las fronteras funcionales de los aislantes.
En particular, el equipo de investigación identificó un nuevo silenciador que inhibe la expresión génica distal. Este silenciador reveló un mecanismo que reprime la transcripción de genes distantes a través de una vía mediada por la histona desacetilasa (HDAC) que actúa sobre los potenciadores adyacentes. También se confirmó la presencia de cientos de silenciadores con características epigenéticas similares distribuidos por todo el genoma.
Además, el equipo utilizó los datos de Swap-seq para validar modelos de aprendizaje profundo de predicción secuencia-función. Los modelos de redes neuronales profundas lograron capturar la actividad cromatínica local de elementos individuales, pero mostraron limitaciones predictivas evidentes al intentar vincular las interacciones a larga distancia con los genes diana distales y los cambios en la expresión.
Significado y perspectivas
Swap-seq abre el camino para evaluar sistemáticamente diversos elementos no codificantes, como potenciadores, silenciadores y aisladores, dentro del mismo contexto genómico endógeno. Esto representa un nuevo punto de inflexión en la investigación de la genómica funcional para esclarecer los mecanismos de patogenicidad de las variantes genéticas de enfermedades complejas y establecer vínculos causales con los genes objetivo. Al identificar con datos reales las causas del fallo en la predicción de interacciones de largo alcance, se proporcionan datos de referencia esenciales para el avance de la próxima generación de modelos de aprendizaje profundo genómico.
Desde la perspectiva de la expansión del genoma completo, también existen desafíos técnicos que deben resolverse. Según el equipo, la eficiencia de la edición de twinPE puede variar según la accesibilidad de la cromatina y las características de la secuencia. Para ampliar el análisis más allá de los loci genéticos individuales hacia elementos reguladores en todo el genoma, es necesario reducir la escala del cribado y los costes de secuenciación. Es el momento de llevar a cabo investigaciones posteriores que completen los mapas reguladores específicos por tipo celular, ampliando la plataforma a diversos modelos celulares de enfermedades y organoides.
Noncoding regulatory elements in the human genome can control gene expression through distinct mechanisms, including acting as enhancers, silencers, or topological elements. However, we lack tools to identify all such classes systematically and quantify their effects on gene expression in an endogenous genomic context. Here we develop Swap-seq, a method that combines pooled twin prime editing with flow-sorting to delete hundreds of endogenous regulatory sequences and measure their quantitative effects on the expression of a nearby gene. We apply Swap-seq to dissect the regulatory elements that control
Este logro promete acelerar el descubrimiento de objetivos en regiones no codificantes, que representan la mayoría de las variantes genéticas causantes de enfermedades pero cuya función es difícil de esclarecer. Esto se debe a que permite demostrar claramente cómo las variantes no codificantes identificadas mediante estudios de asociación del genoma completo (GWAS) —asociadas a la susceptibilidad a enfermedades autoinmunes o al cáncer— alteran genes clave en tipos celulares específicos. En el desarrollo de fármacos, esto permitirá diseñar estrategias para dirigirse con precisión a potenciadores de enfermedades hiperactivados o silenciadores de mecanismos inhibitorios, utilizando oligonucleótidos antisentido (ASO) o fármacos de control epigenético de moléculas pequeñas. También podría utilizarse como un indicador empírico clave para la optimización de promotores y potenciadores sintéticos diseñados para ajustar finamente los niveles de expresión de genes terapéuticos en el campo de las terapias celulares y génicas.