Maximización de la eficiencia de la edición Prime en plantas: trasplante preciso de variantes de resistencia del pimiento al tomate y construcción de multirresistencia
Antecedentes
En los campos de cultivo, las enfermedades bacterianas son un factor principal que provoca una disminución drástica en la producción. A medida que el cambio climático hace que el entorno de cultivo sea inestable, ha aumentado la importancia de las técnicas de mejoramiento para garantizar la resistencia a patógenos complejos. El método tradicional de cría requiere varios cruces recurrentes para introducir el alelo de resistencia deseado, por lo que el desarrollo de nuevas variedades tarda varios años. El problema del arrastre de ligamiento, en el que se introducen también genes silvestres no deseados debido al enlace cromosómico, ha sido un gran obstáculo.
Aunque se ha introducido la tecnología de corte de secuencias diana mediante las tijeras moleculares CRISPR-Cas9, su dependencia de los cortes de doble cadena (DSB) provoca inserciones y deleciones aleatorias, lo que dificulta la inducción de mutaciones precisas. La edición de primos (Prime Editing, PE), que realiza sustituciones, inserciones y deleciones precisas en el sitio objetivo sin cortar el ADN, ha surgido como una alternativa.
El problema es que, a diferencia de las monocotiledóneas como el arroz, la eficiencia de los editores Prime en dicotiledóneas como el tomate era muy baja. Construir sistemas de edición múltiple que corrigen varios genes simultáneamente también resultó complicado. Era urgente desarrollar una plataforma de edición genómica de alta eficiencia capaz de recrear rápida y precisamente variantes naturales útiles de especies silvestres o especies emparentadas en variedades comerciales, para responder a múltiples patógenos.
Hallazgos clave
Los investigadores diseñaron un nuevo sistema de prime editor optimizado para el tomate (Solanum lycopersicum). Se desarrollaron tres tipos de editores Prime para tomate (TomPE2, TomPE6c, TomPE7) con mejoras estructurales y se verificó sistemáticamente su actividad operativa y precisión en función de la temperatura de cultivo y la estructura del editor. De los tres editores, TomPE6c registró la mayor tasa de eficiencia de edición precisa con una minimización de las variaciones fuera del objetivo.
Sobre la base de la plataforma de edición desarrollada, el equipo de investigación emprendió un experimento para reproducir con precisión en el genoma del tomate los alelos naturales de resistencia a enfermedades encontrados en el chile. Se eliminaron con precisión dos residuos de aminoácidos de leucina en los genes SlBs5 y SlBs5L, que codifican proteínas del dominio CYSTM, una familia de proteínas de membrana ricas en cisteína. Esta cepa de tomate corregida, que indujo la pérdida de estos dos aminoácidos, mostró una resistencia significativamente mejorada contra Xanthomonas, el agente causal de la mancha bacteriana. Esto demuestra que es posible trasplantar con precisión variantes beneficiosas identificadas en otras especies de cultivos a cultivos adyacentes para lograr las mismas funciones de defensa.
Paralelamente, el equipo de investigación introdujo codones de terminación prematura en el gen SlDMR6, que interviene en la susceptibilidad a patógenos, para inhibir su función. Como resultado, el organismo editado mostró una resistencia múltiple potente tanto contra Xanthomonas como contra Pseudomonas syringae, el agente causal de la enfermedad de las manchas ulcerosas.
El análisis de perfil transcriptómico reveló que los dos genes de resistencia activan mecanismos inmunológicos distintos. Las variantes Slbs5 y Slbs5L mostraron un estado de defensa inducido por patógenos que, en condiciones normales, suprime la respuesta inmunitaria pero induce rápidamente una respuesta defensiva ante la invasión de patógenos. Por el contrario, la variante Sldmr6 mantuvo un estado de defensa basal con niveles elevados de expresión de genes de defensa incluso antes de la infección.
Los investigadores también completaron un sistema de edición múltiple de prime modular, capaz de corregir simultáneamente varios loci en una sola generación. Lograron acumular en una sola generación alelos de resistencia con diferentes vías de defensa y variantes de regulación de la expresión mediante un único proceso de transformación. La mutación introducida se heredó de forma estable a la siguiente generación, y el fenotipo de resistencia se mantuvo inalterado incluso en ambientes de alta temperatura.
Significado y perspectivas
Este estudio demuestra que la tecnología de edición prime, centrada en monocotiledóneas, se ha expandido con éxito a principales cultivos dicotiledóneos como el tomate, demostrando que es posible reproducir directamente en el laboratorio variantes útiles de la naturaleza. Demuestra que es posible lograr rasgos superiores de otras especies mediante la corrección precisa a nivel de pocos nucleótidos, sin necesidad de cruzamiento interespecífico, sentando así las bases para cambiar el paradigma del desarrollo de nuevas variedades.
La estrategia de combinar en una sola generación los distintos mecanismos de defensa inducida por patógenos y la defensa basal se convierte en un arma poderosa para superar el problema de que la resistencia se vea fácilmente socavada por la aparición de variantes de patógenos. El hecho de que se haya mantenido una resistencia estable a las enfermedades en un entorno de altas temperaturas anómalas derivadas del calentamiento climático es una señal positiva para el futuro desarrollo de variedades de cultivos con resistencia al estrés ambiental combinado.
Para la aplicación práctica comercial, quedan pendientes varios desafíos posteriores. Debe respaldarse la tecnología que permita seleccionar de manera eficiente y multiplicar en masa líneas puras de plantas sin transgenes, es decir, aquellas en las que el gen del vector exógeno ha sido eliminado por completo a partir del organismo transformado. Al ampliar el ámbito de aplicación a otros cultivos de la familia Solanaceae, como pimientos, papas y berenjenas, además del tomate, también se deben continuar las investigaciones de optimización para superar las diferencias entre variedades en la eficiencia de cultivo in vitro y rediferenciación.
La edición por prime permite la modificación precisa de los genomas vegetales y proporciona un medio para recrear alelos beneficiosos subyacentes a rasgos agronómicamente importantes. Sin embargo, los sistemas de edición de primos eficientes y multiplexables siguen siendo limitados en cultivos dicotiledóneos. Aquí, desarrollamos sistemas optimizados de edición primaria para el tomate (Solanum lycopersicum) y los aplicamos para ingeniar y apilar alelos de resistencia a enfermedades. Using three tomato prime editors, TomPE2, TomPE6c, and TomPE7, we recreated a naturally occurring resistance-associated deletion identified in pepper by precisely deleting two leucine residues from the CYSTM-domain proteins SlBs5 and SlBs5L. Las líneas de tomate resultantes mostraron una resistencia mejorada a Xanthomonas, lo que demuestra que un alelo de resistencia puede recrearse funcionalmente entre especies de cultivos relacionadas. En paralelo, la introducción de codones de parada prematuros en el gen de susceptibilidad SlDMR6 confería resistencia tanto a Xanthomonas como a Pseudomonas syringae. El perfilado del transcriptoma reveló estados de defensa distintos: las plantas Slbs5/Slbs5L exhibieron predominantemente respuestas de defensa mejoradas inducidas por patógenos, mientras que las plantas Sldmr6 mostraron una defensa basal elevada. La comparación de las arquitecturas del editor prime y las temperaturas de cultivo reveló diferencias en la actividad y precisión de la edición, con TomPE6c produciendo la mayor proporción de ediciones precisas. Desarrollamos aún más un sistema modular de edición de primers multiplex capaz de modificar simultáneamente múltiples loci, lo que permite combinar alelos de resistencia y variantes regulatorias en una sola generación. Los alelos modificados se heredaron de forma estable y los fenotipos de resistencia se mantuvieron bajo condiciones de temperatura elevada. En conjunto, estos resultados establecen la edición de primacías como una plataforma eficaz para la recreación precisa, ingeniería y apilamiento multiplex de alelos de resistencia a enfermedades, y proporcionan un marco para acelerar el mejoramiento genético por resistencia en cultivos.
Esta tecnología ofrece una solución para suministrar variedades resistentes adaptadas en la agricultura hortícola ante la rápida expansión de nuevas variantes de patógenos debido al cambio climático. Puede reducir el tiempo de desarrollo de variedades con multirresistencia de 5-7 años a solo 1-2 generaciones (aproximadamente 1 año). Para los agricultores, esto permite la adopción temprana de variedades de alta resistencia que protegen el rendimiento y reducen el uso de pesticidas químicos en entornos de infección mixta con Xanthomonas y Pseudomonas. Las empresas de semillas también pueden fortalecer su competitividad en el mercado global de semillas al establecer una canalización modular de fitomejoramiento que permita benchmarkear y acumular rápidamente los genes superiores naturales de otros cultivos en sus líneas.