Editor prime con transcriptasa inversa murina modificada logra una eficiencia media de 1,88 veces la de referencia en dianas difíciles
Contexto: la transcriptasa inversa influye en la eficiencia de la edición prime
Un editor prime con una transcriptasa inversa de origen murino modificada mostró mayor eficiencia de edición que las herramientas existentes en las células humanas y los protoplastos de arroz evaluados. El sistema desarrollado por el equipo, basado en enRERV-RT, alcanzó una eficiencia relativa media de 1,20 en la comparación general de dianas endógenas y de 1,88 en cuatro dianas endógenas difíciles de editar. Son resultados de experimentos celulares y vegetales; el estudio no evaluó efectos terapéuticos en pacientes.
La edición prime permite introducir sustituciones de bases o inserciones y deleciones de secuencias cortas sin provocar roturas de doble cadena del ADN. Una variante de Cas9 que corta una sola hebra actúa junto con una transcriptasa inversa (RT) y un ARN guía de edición prime (pegRNA) que contiene las instrucciones de edición. La RT es el componente clave que copia al ADN la información de edición contenida en el ARN. Como hay pocas opciones de enzimas eficientes, el equipo buscó alternativas a la RT del virus de la leucemia murina de Moloney (M-MLV-RT), de uso extendido.
Hallazgos principales: de la búsqueda de candidatos a la validación en dianas difíciles
El equipo realizó un análisis filogenético de 558 secuencias únicas de RT seleccionadas de bases de datos y probó 54 candidatos representativos en protoplastos de arroz. Diecinueve enzimas mostraron actividad en un ensayo con un indicador fluorescente. En evaluaciones posteriores de dianas endógenas, la RERV-RT, derivada de un retrovirus endógeno murino, presentó la actividad más alta.
Para modificar la enzima, compararon la estructura de RERV-RT predicha con AlphaFold 3 con una estructura de M-MLV-RT obtenida por criomicroscopía electrónica. Primero crearon RERV-m5 mediante la introducción de cinco mutaciones. A esta variante añadieron W149F, identificada mediante un análisis mutacional profundo, y las mutaciones beneficiosas adicionales Y68R y C413R para obtener la enzima final, enRERV-RT.
La eficiencia de edición fue, en promedio, de 1,17 veces la de los editores basados en M-MLV en siete dianas de células HEK293T derivadas de riñón embrionario humano y de 1,22 veces la de referencia en seis dianas de protoplastos de arroz. La eficiencia relativa media en las 13 dianas de ambos sistemas experimentales fue de 1,20. En cuatro dianas difíciles de editar en células HeLa y fibroblastos dérmicos humanos primarios, la eficiencia media fue de 1,88 veces la de referencia. Los experimentos incluyeron la inserción de una etiqueta FLAG de 24 pares de bases y una etiqueta 6×His de 18 pares de bases en fibroblastos.
El equipo también desarrolló TRAP-seq-PE, una plataforma de evaluación en la que se integraron 475 constructos pegRNA–diana en el genoma de células HEK293T. Mide la proporción de ediciones previstas mediante secuenciación profunda del ADN diana, lo que permite comparar la eficiencia de varias sustituciones, inserciones y deleciones. En esta biblioteca, la eficiencia media global de los editores basados en enRERV fue de aproximadamente 1,8 veces la de las herramientas existentes, y de aproximadamente 2,74 veces en el grupo de dianas difíciles de editar. Estas cifras deben distinguirse de la eficiencia relativa media de 1,88 en cuatro dianas endógenas.
Implicaciones y perspectivas: más opciones de herramientas y validación para cada aplicación
La edición múltiple se demostró en experimentos con arroz usando la variante anterior RERV-m5. De 60 plantas de arroz regeneradas, 28 presentaron edición simultánea de tres genes, una proporción del 46,7 %. En experimentos separados con arroz regenerado y la versión final enRERV, se confirmó actividad de edición en dos dianas endógenas.
También se realizaron experimentos para introducir codones de terminación en cuatro genes relacionados con las células T con receptor de antígeno quimérico (CAR-T). Sin embargo, no se comprobaron directamente mejoras en la actividad antitumoral ni en la persistencia de las células CAR-T. La evaluación de seguridad también tiene un alcance limitado. El resultado de no detectar mutaciones en 12 sitios predichos fuera de la diana se limita al arroz editado con RERV-m5. En 17 eventos de edición en células vegetales y animales, no se observó una diferencia importante en los subproductos de edición entre los sistemas basados en enRERV y M-MLV.
Los autores propusieron que las diferencias en los métodos de entrega y expresión y en el entorno de la cromatina podrían explicar las distintas magnitudes de mejora de la eficiencia entre la biblioteca y las dianas endógenas. Es una explicación posible, no un mecanismo demostrado directamente. Para su aplicación en terapia o mejora vegetal, habrá que evaluar más la eficiencia, los subproductos y la seguridad en las células y dianas previstas. El estudio se publicó en Advanced Science; el diseño experimental y los resultados pueden consultarse en el artículo completo.
CRISPR-based prime editors (PEs) install precise edits into genomic DNA without generating double-strand breaks. Their editing efficiency is highly dependent on reverse transcriptases (RTs), but efficient RT candidates remain limited. Here, we identified 19 novel active RTs by screening 558 candidates. Among them, RERV-RT, derived from Rattus norvegicus, exhibited the highest activity. Through structure-guided engineering and deep mutational scanning, we developed an optimized variant, enRERV-RT, which outperforms conventional M-MLV-RT-based PE systems by 1.20-fold in mammalian and plant cells, and by 1.88-fold at hard-to-edit loci, while enabling precise multiplex editing of functionally relevant genes. Additionally, we developed a high-throughput platform, TRAP-seq-PE, to systematically evaluate prime editor performance. Across diverse mutation types, we found that PE systems based on enRERV-RT exhibited higher editing efficiencies than those based on M-MLV-RT. Collectively, our work establishes a versatile, high-efficiency PE system, thereby facilitating advances in clinical gene therapy and precise crop breeding.
Los equipos que obtienen una baja eficiencia de edición prime en determinadas dianas cuentan ahora con otra transcriptasa inversa para comparar. Si la inserción de una secuencia deseada resulta ineficiente, pueden diseñar experimentos que comparen herramientas basadas en M-MLV y en enRERV en las mismas células, dianas y condiciones de entrega, y medir conjuntamente las ediciones previstas y los subproductos. TRAP-seq-PE permite comparar el rendimiento entre varios tipos de edición, pero debe ir seguido de una validación en dianas endógenas reales. En investigación de mejora vegetal, los resultados de edición en arroz regenerado pueden servir como punto de partida para comprobar el rasgo deseado y su herencia en generaciones posteriores. En el ámbito terapéutico, el trabajo aporta una herramienta candidata, pero aún no puede interpretarse como una demostración de eficacia en pacientes, seguridad clínica o reducción del tiempo hasta la autorización regulatoria.