SPELL reduce la complementariedad interna del ARN guía de edición prime para facilitar la optimización del diseño
Contexto: el apareamiento interno del ARN guía puede alterar la eficiencia de edición
Reducir la complementariedad interna de los ARN guía para edición prime (pegRNA) puede mejorar la eficiencia de edición. SPELL aplica este principio y, en varias dianas, alcanzó eficiencias cercanas a las de diseños existentes sin optimizar previamente el PBS. El estudio, publicado en Nucleic Acids Research, evaluó parámetros de diseño del ARN guía mediante análisis de la literatura y experimentos en células de origen humano.
La edición prime modifica secuencias de ADN usando la información contenida en un ARN guía. El sitio de unión del cebador (PBS) se aparea con el extremo 3′ de la cadena de ADN que presenta un corte y ayuda a iniciar la transcripción inversa. Sin embargo, si el PBS se aparea por complementariedad con la región espaciadora del mismo pegRNA, puede interferir con la edición. Por eso, al determinar la longitud del PBS hay que tener en cuenta tanto su unión al ADN como las interacciones internas del ARN.
El equipo analizó datos existentes de unos 3.000 pegRNA y pegRNA con protección terminal (epegRNA). A diferencia de observaciones previas según las cuales la protección terminal acorta la longitud óptima del PBS, este análisis no encontró una diferencia clara entre ambos tipos en la longitud del PBS asociada a la mayor eficiencia media de edición. El resultado indica que es difícil generalizar los criterios de longitud obtenidos para una diana concreta.
Hallazgos principales: mejora de la eficiencia con desajustes y simplificación del diseño con SPELL
El equipo probó más de 300 pegRNA modificados para debilitar la interacción entre el PBS y el espaciador. En un sistema indicador fluorescente basado en plásmidos en células HEK293T, determinados desajustes de un solo nucleótido en el espaciador elevaron la eficiencia de edición hasta 7,2 veces la del control correspondiente sin desajuste. El efecto fue más marcado con longitudes de PBS no óptimas, y no todos los desajustes fueron beneficiosos. Entre 46 diseños con un desajuste único en una posición alejada del PAM, dentro de la región espaciadora complementaria al PBS, 24 aumentaron significativamente la eficiencia y uno la redujo. El PAM es una secuencia adyacente que Cas9 necesita para reconocer su diana.
SPELL busca reducir la carga de optimizar exhaustivamente cada combinación. Introduce una deleción de un solo nucleótido en PBS de 17–20 nucleótidos; en la comparación principal en dianas genómicas, se eliminó el nucleótido de la posición 13 de un PBS de 20 nucleótidos. Se trata de un cambio en el diseño del ARN guía, distinto de una deleción que se pretenda introducir en el ADN diana.
En la comparación global de 25 pegRNA analizados en células HEK293T, no se observó una diferencia significativa en la actividad de edición entre SPELL y los diseños con PBS corto. Esto no demostró equivalencia estadística. En tres de los siete grupos de diseños incluidos en la comparación, la eficiencia fue significativamente menor que con los diseños existentes. En la línea de células madre embrionarias humanas HuES9, la eficiencia para la diana GBA1 fue 1,5 veces la del diseño basado en la literatura, mientras que para LRRK2 no hubo una diferencia significativa.
Significado y perspectivas: candidato inicial que aún requiere validación para cada diana
La principal aportación de SPELL es haber obtenido, con un diseño relativamente sencillo —una deleción de un solo nucleótido en un PBS largo—, un rendimiento cercano al de diseños de PBS existentes en varias dianas. La combinación con desajustes en el espaciador produjo una eficiencia superior a la del PBS óptimo para algunas dianas, pero encontrar la mejor combinación requirió una optimización extensa. Por tanto, la mejora máxima de 7,2 veces observada en experimentos concretos con desajustes no debe interpretarse como un efecto universal de SPELL.
El mecanismo de acción tampoco se conoce por completo. El efecto inhibidor de la complementariedad interna no siempre se manifestó como una reducción de la actividad de corte de Cas9, y el equipo planteó que podrían verse afectados pasos posteriores, como el inicio de la transcripción inversa. En las condiciones evaluadas no hubo indicios de un aumento de las inserciones o deleciones no deseadas ni de la edición en algunos sitios conocidos fuera de la diana. Sin embargo, el estudio no demostró seguridad integral ni eficacia terapéutica en pacientes. El rendimiento con la administración de complejos proteína–ARN (RNP) también requiere una evaluación sistemática adicional.
El diseño y los resultados del estudio pueden consultarse en el texto completo del artículo.
The length and sequence of the primer binding site (PBS) are critical for efficient prime editing, and its intramolecular complementarity with the prime editing guide RNA (pegRNA) spacer is a major drawback. We investigated the effects of these factors by literature analyses and by testing over 300 modified pegRNAs with weakened PBS-spacer interactions. It has been suggested that the effective PBS length for plasmid-delivered pegRNAs without end protection is considerably longer than what efficient priming requires due to exonuclease digestion of the PBS ends; however, analysing literature data of over 3000 pegRNAs revealed no significant shift in the optimal PBS length for epegRNAs compared to conventional pegRNAs. We also found improvement in editing efficiency with up to seven-fold when mismatches were introduced in the spacer or PBS sequence disrupting complementarity, although this effect is more pronounced with non-optimal PBS lengths. A combination of spacer mismatches and PBS deletions led to further editing improvements, even compared to the optimal PBS, although finding the best combination requires extensive optimization. Here, we achieved near-optimal editing efficiency in the majority of cases without the need for prior pegRNA optimization by using SPELL ("Streamlined Prime Editing with fixed-Length PBS Leverage"), a prime editing approach that employs a 17-20 nucleotide-long PBS with a single nucleotide deletion.
Al diseñar pegRNA para una nueva diana en estudios celulares de función génica, SPELL puede considerarse como candidato inicial para probar junto con diseños de PBS existentes. Una estrategia consiste en comprobar si un diseño con PBS largo y una deleción de un solo nucleótido ofrece una eficiencia de edición adecuada antes de explorar ampliamente distintas longitudes de PBS. Como el rendimiento fue menor en algunas dianas, deben compararse para cada una la eficiencia de edición y las inserciones o deleciones no deseadas. También debe reevaluarse el rendimiento al cambiar el método de administración o el tipo celular. Estos resultados respaldan la posibilidad de reducir el esfuerzo de exploración del diseño, pero no demuestran cuánto tiempo o coste se ahorraría realmente, una reducción del tiempo de desarrollo de medicamentos ni seguridad clínica.