LEMONmethyl-seq sigue los cambios temporales tras la edición epigenómica con CRISPR mediante el análisis dirigido de la metilación del ADN con lecturas largas
Antecedentes: el reto de leer la metilación en regiones largas de ADN
El método de análisis de metilación del ADN LEMONmethyl-seq detectó la formación y propagación de la metilación alrededor de las regiones diana después de la edición epigenómica con CRISPR en células cultivadas. El estudio, difundido como prepublicación en bioRxiv, presenta un método para analizar regiones específicas de ADN con resolución de una base y también examina patrones de metilación asociados con la sensibilidad a fármacos en líneas celulares de glioblastoma.
La metilación del ADN interviene en la diferenciación celular y la expresión génica, y también cambia durante las enfermedades y el envejecimiento. El análisis convencional de regiones diana mediante bisulfito daña el ADN durante el procesamiento y suele ser adecuado para amplificar regiones cortas de 200–300 pares de bases. Para leer regiones más largas se necesita un procedimiento que registre la información de metilación en la secuencia y, al mismo tiempo, limite el daño del ADN. Si se amplifica directamente el ADN original mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la información de metilación se pierde.
Hallazgos principales: patrones de metilación registrados mediante conversión enzimática
El nombre completo de LEMONmethyl-seq es Locus-Enriched Mapping Of Nucleotide methylation. El equipo de investigación empleó conversión enzimática de metilación (EM conversion) para proteger las citosinas modificadas y convertir las citosinas no modificadas en uracilo; después amplificó las regiones diana con la polimerasa KeyPo SE. A continuación, leyó las secuencias mediante secuenciación de lecturas largas de Oxford Nanopore, distinguiendo las posiciones que permanecieron como C de las que cambiaron a T. Como esta conversión protege tanto la 5-metilcitosina (5mC) como la 5-hidroximetilcitosina (5hmC), el análisis no permite distinguir entre ambas modificaciones.
En el promotor HIST2H2BE, se amplificó de una sola vez una región de unas 4,5 kilobases (kb) y se obtuvieron más de 3.000 lecturas. Los datos de PCR con bisulfito usados para la comparación constaban de 7–10 lecturas de Sanger por región, y ambos métodos mostraron tendencias de metilación similares. El equipo informó que el costo total de LEMONmethyl-seq era menor. La profundidad de lectura en la diana CD55 fue más de 300 veces la obtenida con la secuenciación enzimática de metilación del genoma completo (WGEM-seq), realizada con una profundidad media genómica de 36×. Esta comparación se limita a la diana seleccionada y a las condiciones experimentales.
En los promotores CD55 y CLTA de células HEK293T tratadas con CRISPRoff, apareció metilación en algunos sitios CpG a las 8 horas. A las 48 horas alcanzó niveles altos en las regiones amplificadas y se mantuvo así a las 72 horas. Los cambios iniciales comenzaron alrededor de los sitios de unión del ARN guía y luego se extendieron a regiones más amplias.
En un experimento de transición de células madre pluripotentes humanas H9 del estado primado al estado naïve, se observó una disminución de la metilación de elementos transponibles. Por separado, también se detectó metilación CpH en la diana CD81 de neuronas derivadas de células madre pluripotentes inducidas y tratadas con CRISPRoff. CpH designa una secuencia en la que después de la citosina aparece A, C o T. En 19 sitios CpH del grupo tratado, se observó metilación en más del 3% de las lecturas de cada sitio.
Implicaciones y perspectivas: posibilidades y límites en la exploración de biomarcadores
En cinco líneas celulares de glioblastoma se analizó una región de unos 1,6 kb que abarcaba el promotor MGMT y el inicio de la región codificante. Las dos líneas sensibles a temozolomida (TMZ) presentaron una metilación media mayor que las tres resistentes. El equipo comparó 120 sitios CpG y encontró diferencias incluso fuera de las regiones cubiertas por las pruebas clínicas existentes. Se trata de una asociación entre líneas celulares; el estudio no validó el rendimiento para predecir la respuesta al tratamiento en pacientes.
El alcance del análisis está limitado por la longitud del amplicón y depende de una secuencia de referencia precisa. El procedimiento actual proporciona información de metilación de una sola hebra. Por tanto, la observación de cambios alrededor de las dianas seleccionadas no puede ampliarse a la vigilancia de efectos fuera de objetivo en todo el genoma ni a la validación de la seguridad clínica. Los resultados deben interpretarse en el marco de un estudio metodológico en células y en fase de prepublicación.
Fuente: Texto completo del estudio LEMONmethyl-seq.
BACKGROUND: DNA methylation is the most prevalent epigenetic modification in human cells and undergoes dynamic changes during cell differentiation, disease progression, and aging. Here, we introduce L ocus- E nriched M apping O f N ucleotide methylation (LEMONmethyl-seq): an optimized, cost-effective pipeline for single-nucleotide detection of DNA methylation using locus-specific amplification and long-read DNA sequencing. RESULTS: We apply LEMONmethyl-seq to profile DNA methylation of endogenous gene promoters across different cell types along with DNA methylation establishment and long-range propagation induced by CRISPR epigenome editing technologies. We profile dynamic changes in DNA methylation patterns on transposable element genomic loci during global epigenetic resetting in stem cells, and we identify site-specific enrichment of non-canonical CpH methylation on genomic sites in stem cells and cultured neurons. Lastly, we apply LEMONmethyl-seq to profile DNA methylation across the CONCLUSIONS: Together, LEMONmethyl-seq serves as a cost-effective, long-read DNA methylation sequencing pipeline that advances methods for detecting DNA methylation patterns and dynamics in mammalian cells. We envision its broad use for studying chromatin pathways, diagnostics, and therapeutic applications.
Quienes investigan la edición epigenómica pueden utilizar LEMONmethyl-seq para comparar cuándo se forma la metilación en promotores seleccionados y hasta dónde se propaga. Por ejemplo, analizar CD55 y CLTA en varios momentos después del tratamiento con CRISPRoff podría ayudar a estudiar cómo se relaciona la supresión de la expresión proteica con la formación de metilación del ADN. En MGMT, los sitios CpG fuera de las regiones cubiertas por las pruebas existentes podrían explorarse como candidatos a biomarcadores en estudios posteriores. Sin embargo, el análisis de regiones diana por sí solo no permite determinar la seguridad en todo el genoma, y aplicar a pacientes la asociación con la sensibilidad a fármacos observada en líneas celulares requeriría una validación clínica independiente. La ventaja de costo comunicada también debe evaluarse distinguiendo las condiciones de comparación del estudio del entorno real de análisis.