Antecedentes

La luz es la señal ambiental más potente para sincronizar el reloj biológico con el ciclo de día y noche. El cerebro central de la Drosophila adulta contiene aproximadamente 240 neuronas circadianas, con más de 25 subtipos identificados mediante análisis de conectividad. Aunque un número tan reducido de células regula el sueño, la vigilia y los tiempos de actividad, no se ha determinado con suficiente claridad qué genes expresa cada neurona y cómo responde a la luz.

La secuenciación de ARN de célula única convencional procesaba muestras de diferentes momentos por separado, lo que dificultaba distinguir los efectos técnicos de lote de los cambios circadianos reales. Además, existía el problema de la pérdida de neuronas neurosecretoras grandes y frágiles durante el proceso de separación celular. Específicamente, las neuronas ventrolaterales externas (l-LNv) de gran tamaño y algunas neuronas dorsolaterales (LNd) se capturaron en menor número de las que realmente existen en el cerebro. Como resultado, quedaron limitaciones para separar la transcripción inducida directamente por la luz de los ritmos generados por el reloj interno celular.

Hallazgos clave

El equipo de investigación de la Universidad Brandeis de Estados Unidos optimizó EL-INTACT, una técnica para aislar núcleos marcados a partir de cabezas de moscas de la fruta congeladas, para su integración con la secuenciación de ARN de núcleo único (snRNA-seq). Además, utilizaron las variantes de un solo nucleótido (SNV) del panel de referencia genético de moscas de la fruta (DGRP) como marcadores de muestra. Se trata de un diseño que reduce el efecto del lote en los experimentos de 10x Genomics, procesando conjuntamente núcleos de diferentes zonas horarias y rastreando hacia atrás las condiciones originales mediante el tipo genético.

El equipo de investigación analizó 12 puntos temporales con intervalos de dos horas bajo condiciones de ciclo luz-oscuridad y oscuridad continua. Se identificaron 9.899 núcleos de neuronas circadianas en el ciclo luz-oscuridad y 9.835 en el segundo día de oscuridad continua, clasificándose ambos conjuntos de datos en 24 grupos de transcritos. También se recuperaron neuronas neurosecretoras raras, incluidas las l-LNv, que habían pasado casi desapercibidas en análisis anteriores. Ello implica un aumento considerable de la densidad de muestreo para detectar los cambios por franja horaria.

En varios tipos de neuronas, los mismos conjuntos celulares se separaron claramente según el momento de la recolección, y múltiples transcritos, incluidos genes clave del reloj biológico como timeless y Pdp1, oscilaron incluso en oscuridad continua. Esto evidencia que la mayoría de los cambios observados no son simples transiciones de luz-oscuridad, sino que derivan de la regulación transcripcional circadiana intrínseca de las células. Los investigadores determinaron el ritmo circadiano de 24 horas por gen aplicando el algoritmo JTK_cycle, utilizando también criterios estrictos que reflejan la expresión máxima y una amplitud de al menos el doble.

Los transcriptos que dependen únicamente de la luz fueron menos de lo esperado. Sin embargo, Hr38 y stripe (sr), que corresponden a los genes de respuesta inmediata en mamíferos, mostraron un aumento breve y fuerte de la expresión en las LNv en el momento del encendido de la luz. Dos horas antes y dos horas después del encendido, así como en condiciones de oscuridad continua al mismo momento, casi no se detectó señal. Los análisis adicionales a los 15, 30 y 60 minutos tras el encendido respaldaron que esta respuesta es una onda transcripcional transitoria y no un aumento sostenido. Un punto clave es que no todas las neuronas circadianas reaccionan de la misma manera.

Significado y perspectivas

Este estudio demuestra que el reloj biológico del cerebro de la Drosophila no es un oscilador uniforme, sino una red con ritmos transcripcionales y respuestas a la luz únicos para cada tipo de neurona. Se plantea la posibilidad de que la luz externa ajuste el reloj interno no cambiando masivamente la expresión génica, sino activando momentáneamente genes dependientes de la actividad, como Hr38 y sr, en ciertas neuronas. Esta reacción es candidata a ser el vínculo molecular que provoca la sincronización circadiana o el desplazamiento de fase.

La multiplexación de EL-INTACT y DGRP también es significativa en el sentido de que permite analizar los transcriptomas temporales de células raras con un efecto mínimo de lote. Al poder utilizar muestras congeladas, resulta más sencillo recopilar previamente múltiples condiciones y puntos temporales para procesarlos conjuntamente. Sin embargo, no se puede afirmar categóricamente que Hr38 y sr sean la causa del control de la fase conductual basándose únicamente en la correlación temporal de los transcriptomas. Se debe combinar la inhibición funcional por gen, la medición de la actividad neuronal y el análisis del ritmo conductual para confirmar el papel causal de cada neurona. También queda pendiente como tarea posterior determinar si las respuestas específicas de los tipos celulares obtenidas en Drosophila se conservan en el núcleo supraquiasmático de los mamíferos.