Antecedentes

Varios virus patógenos, como el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), el virus de la hepatitis B (VHB) y el virus del herpes simple, penetran en las células del huésped insertando su material genético en el genoma o permaneciendo ocultos en forma de episomas circulares. Aunque los antivirales pueden inhibir la replicación viral en sangre, no logran eliminar los reservorios latentes ocultos en la cromatina. Esto provoca que el virus se reactive y reanude su replicación en el momento en que el paciente interrumpe el tratamiento.

Investigadores de biología molecular han intentado utilizar la herramienta de edición genética CRISPR-Cas9 para cortar directamente el ADN viral insertado en los cromosomas del huésped. Sin embargo, el método de inducir rupturas de doble cadena (DSB) en el genoma humano conlleva inevitablemente el riesgo de cortes fuera de objetivo (off-target cleavage). No se puede descartar la posibilidad de inestabilidad genómica fatal, como translocaciones cromosómicas, deleciones a gran escala o la activación de genes oncogénicos. En particular, el daño a secuencias humanas endógenas similares a las virales provoca una citotoxicidad grave que ha obstaculizado su avance clínico. Por ello, era urgente desarrollar una nueva tecnología de control molecular que pudiera bloquear selectivamente la expresión de genes virales latentes sin dañar directamente la secuencia genética.

Hallazgo clave

En lugar de cortar la secuencia de ADN, el equipo desarrolló una plataforma de edición epigenética que modifica químicamente la estructura de la cromatina. Diseñaron un complejo que fusiona una proteína Cas9 inactiva (catalytically dead Cas9, dCas9), carente de actividad de corte, con el dominio catalítico de ADN metiltransferasa (DNMT) y el dominio KRAB (Kruppel-associated box), un factor de transcripción represor. El ARN guía (gRNA) se diseñó para reconocer con precisión la secuencia de la repetición terminal larga (LTR), una región crítica de inicio de la transcripción en el promotor viral.

Al aplicar el complejo en un modelo de infección latente de células T humanas in vitro, se observó un efecto inhibitorio sorprendente. La tasa de metilación del carbono 5 en las citosinas de las islas CpG dentro de la región LTR objetivo aumentó en más de un 82% respecto al estado basal. Simultáneamente, la concentración del marcador histónico represor H3K9me3 (trimetilación de la lisina 9 de la histona H3) aumentó más de 4 veces, lo que indujo rápidamente la heterocromatinización con una compactación densa de la cromatina.

In latent reverse transcription assays that induce viral reactivation using potent chemical stimulants, the production of viral RNA transcripts remained suppressed by more than 98%. This was due to blocking the access path so that transcriptional activators could not physically bind to the promoter. Of particular note is its persistence. A pesar de que el equipo de investigación realizó un seguimiento y observación mientras dividía las células cultivadas más de 60 veces, la marca de metilación se replicó de manera estable durante el proceso de división celular, manteniendo el estado de silenciamiento de la expresión viral. Los resultados del análisis de secuenciación de transcriptoma completo (RNA-seq) y de la secuenciación de bisulfito de todo el genoma (WGBS) mostraron que la alteración no específica de la expresión de los genes del huésped humano y las anomalías en la estructura cromosómica se encontraban por debajo del límite de detección.

Significado y perspectivas

Este logro representa un cambio de paradigma al neutralizar funcionalmente a los virus sin realizar cortes genómicos. Demuestra que, incluso sin extirpar completamente los virus de los reservorios latentes, si se fija la huella genética en un estado inactivo, se puede avanzar hacia una cura funcional sin necesidad de antivirales. Se espera que la aplicación se extienda a diversas enfermedades virales intratables, como el virus del herpes simple que permanece latente en los ganglios nerviosos tras la infección, o la hepatitis B crónica que persiste como cccDNA en el núcleo de las células hepáticas.

La tarea también es clara. Es esencial optimizar los sistemas de administración in vivo para que el complejo de edición llegue a tejidos profundos y células inmunitarias latentes en organismos vivos. Se debe minimizar la respuesta inmunitaria durante el proceso de entrega a tejidos objetivo mediante nanopartículas lipídicas (LNP) o vectores de virus adenoasociados (AAV). A largo plazo, se requieren investigaciones de seguimiento en modelos de primates no humanos para verificar si el estado de silenciamiento epigenético se mantiene sin revertirse durante varios años.