Limitaciones de la edición prime en bacterias

La edición prime es una tecnología que permite modificar genes con precisión sin generar roturas de doble cadena en el ADN. El equipo de investigación desarrolló PE-STAR en Escherichia coli combinando la modulación de la reparación del ADN con la selección de células editadas, y comunicó eficiencias de edición de aproximadamente el 80–90 % en condiciones específicas. Estas cifras representan la proporción con la edición deseada en la población después de la selección.

En las bacterias, las enzimas que procesan los intermediarios de edición y las vías de reparación del ADN influyen en los resultados de la edición. Los métodos anteriores tenían una eficiencia baja o limitaban la longitud de las secuencias que podían modificarse. El equipo construyó PE-STAR a partir de la cepa ES95, derivada de E. coli MG1655 mediante la eliminación de tres genes de exonucleasas: sbcB, exoX y xseA.

Refuerzo de las vías de reparación y selección basada en SOS

Eliminar las tres enzimas puede reducir la degradación de la hebra de ADN editada producida por retrotranscripción. Los investigadores también prolongaron el periodo de cultivo después de la transformación y sobreexpresaron la enzima RecJ. Los autores propusieron un modelo en el que RecJ favorece el procesamiento en dirección 5′ de la hebra competidora sin editar, creando condiciones que facilitan la incorporación de la hebra editada al genoma.

Para aumentar la proporción de células editadas, el equipo también introdujo un circuito SOS que responde al daño del ADN. Vincularon PE3, que genera un corte monocatenario en cada una de las dos hebras de ADN, con la expresión de ARN guía regulada por LexA, y diseñaron la nucleasa MAD7 para eliminar un plásmido de contraselección que portaba el gen de la toxina CcdB. La inducción posterior de la expresión de la toxina reduce las células sin editar que conservan el plásmido. La proporción de edición que aumenta con este proceso no debe interpretarse como la probabilidad de supervivencia de las células editadas.

La eficiencia varió según el tipo, la longitud y la posición de la edición. Una inserción de una sola base en xylB alcanzó el 82,41 % en condiciones específicas, y las deleciones de 5 bp y 10 bp llegaron a cerca del 90 %. En cambio, la eficiencia de las inserciones de 10 bp aumentó del 0,44 % al 6,78 %, y la de las inserciones de 30 bp, del 11,76 % al 27,40 %. El sistema permitió inserciones, deleciones y sustituciones de hasta 46 bp, aunque no todas mostraron la misma eficiencia. En galK y lacZ se observaron mejoras de hasta 16 veces respecto al sistema PE2 existente. La eficiencia en xylB se evaluó mediante el análisis de la secuencia de la región diana de colonias recogidas después de la selección; en galK y lacZ, se evaluó mediante el fenotipo de color de las colonias.

Integración de grandes rutas genéticas y retos pendientes

Para insertar casetes largos de ADN se utilizó una etapa de recombinación aparte. Primero, PE-STAR instaló en el cromosoma un sitio de reconocimiento attB de 46 bp. Después, el equipo empleó la integrasa Bxb1 para integrar, por separado, un casete de proteína verde fluorescente (GFP) de 3,2 kb y una ruta de biosíntesis de riboflavina de 8,0 kb. Se confirmó la integración correcta en todas las colonias examinadas después de la selección. Este 100 % no representa la tasa de éxito entre todas las células iniciales ni la del proceso completo de dos etapas.

En la cepa con la ruta de riboflavina, la concentración de riboflavina en el sobrenadante del cultivo alcanzó un máximo de 3,23 mg/L durante 96 horas de cultivo. Sin embargo, la densidad óptica a 600 nm (OD600), un indicador de la densidad celular, fue menor en la cepa con la ruta integrada: 2,72 frente a 3,27 en el control, lo que indicó una carga para el crecimiento. Los resultados constituyen una demostración de laboratorio que conecta la edición precisa con la instalación de una ruta metabólica en E. coli. Quedan por validar el rendimiento en otras bacterias y la productividad a escala industrial.

Los métodos y resultados pueden consultarse en el texto completo de acceso abierto del artículo de Nucleic Acids Research. DOI: 10.1093/nar/gkag285.