La transcriptasa inversa Tf1 y la optimización de codones triplican la eficiencia de inserción de etiquetas génicas en una diana del arroz
Contexto
Un estudio publicado en aBIOTECH optimizó una herramienta existente de edición del genoma del arroz y triplicó, en una diana concreta, la proporción de plantas con inserción precisa de una etiqueta para detectar proteínas. Los cambios clave fueron introducir una variante de la transcriptasa inversa Tf1 y optimizar el uso de codones. También se observaron ediciones no deseadas, por lo que los resultados no demuestran una mejora general de la precisión de edición.
El sistema de edición prime mediada por nucleasa (NM-PE), desarrollado previamente por el equipo, combina la nucleasa SpCas9 con la edición prime basada en la unión de extremos mediada por microhomología (MMEJ). Permite insertar secuencias de etiquetado para identificar proteínas en genes endógenos de plantas, pero seguía pendiente mejorar la eficiencia de inserción de la etiqueta 3 × FLAG, relativamente larga. Este estudio se centró en mejorar el rendimiento modificando componentes del sistema existente.
Hallazgos principales
El equipo sustituyó la transcriptasa inversa derivada del virus de la leucemia murina de Moloney (M-MLV) por evoTf1M4, una variante de la familia Tf1 utilizada en el sistema PE6 de mamíferos. Después comparó construcciones que codificaban la misma proteína, pero utilizaban codones diferentes. La optimización de codones ajusta la secuencia de nucleótidos que codifica una proteína sin cambiar su secuencia de aminoácidos. Los experimentos se realizaron con la variedad de arroz Kitaake y se analizaron transformantes primarios (T0) independientes en los que se habían introducido las construcciones de edición mediante Agrobacterium.
La construcción inicial rPE20a no produjo inserciones precisas detectables de la etiqueta en ninguno de los tres loci evaluados. En cambio, rPE20aV3, optimizada según el uso de codones del maíz, mostró la mayor eficiencia de inserción en los experimentos con arroz. Sustituir únicamente la transcriptasa inversa por una variante Tf1 no garantizó una mejora del rendimiento. El estudio tampoco demostró la causa molecular de estas diferencias.
En los experimentos de inserción de la secuencia 3 × FLAG de 66 pares de bases (bp), rPE20aV3 generó inserciones precisas en 9 de 48 plantas T0 en la diana OsCPK6. La proporción fue del 18,75 %, tres veces el 6,25 % (3 de 48) obtenido con la construcción original rPE14b. Estas proporciones representan la fracción de plantas transformadas con inserciones precisas confirmadas, no la proporción de moléculas editadas respecto al total de moléculas de ADN. En las otras dianas, OsCPK3 y OsCPK4, los resultados fueron 7/48 plantas (14,6 %) y 5/48 plantas (10,4 %), respectivamente. El equipo confirmó las inserciones mediante secuenciación y detectó por inmunoblot señales compatibles con los pesos moleculares esperados de las proteínas etiquetadas.
Para introducir mutaciones puntuales se utilizó una construcción distinta, rPE20c. En OsACCase, la edición precisa no se detectó con la construcción de comparación rPE14a, pero sí se confirmó en 5 de 45 plantas (11,1 %) con rPE20c. Sin embargo, en OsGS3, rPE14a y rPE20c dieron el mismo resultado: 7/48 plantas (14,6 %). La mejora dependió de la diana.
Significado y perspectivas
El resultado puede interpretarse como una mejora de una herramienta de genómica funcional para añadir etiquetas de detección a proteínas endógenas del arroz. Una mayor proporción de plantas con inserciones precisas podría ayudar a obtener líneas experimentales para análisis posteriores.
Las limitaciones son claras. En los tres loci evaluados para la inserción de etiquetas se observaron ediciones no deseadas, como pequeñas inserciones o deleciones e inserciones incompletas de la etiqueta. Detectar las proteínas etiquetadas no demuestra que se hayan conservado las funciones de las proteínas originales. Estos resultados tampoco permiten determinar la reproducibilidad en otras variedades o cultivos, la estabilidad en generaciones posteriores ni posibles mejoras del rendimiento o de la tolerancia al estrés. Su aplicación práctica requerirá optimizar cada diana y validar individualmente las líneas editadas.
Los resultados y las condiciones experimentales se describen en el artículo original de aBIOTECH.
The development of efficient and precise genome-editing tools is crucial for advancing functional genomics and improving crops. Our previously established nuclease-mediated prime editing (NM-PE) system, which combines the Tf1 reverse transcriptase with a CRISPR-Cas system, has shown great potential in editing plant genomes with high precision and efficiency.
Al estudiar la función de genes del arroz, añadir una etiqueta de detección a una proteína endógena puede ayudar a identificarla en experimentos. Por ejemplo, quienes analicen proteínas de la familia OsCPK podrían considerar generar líneas con una inserción 3 × FLAG y comprobar mediante inmunoblot si la proteína etiquetada es detectable. Esta optimización puede aumentar la probabilidad de obtener plantas con inserciones precisas en algunas dianas. El estudio no midió reducciones de costos ni de tiempo. Será necesario examinar las líneas para detectar ediciones no deseadas y evaluar si la etiqueta afecta a la función de la proteína; estos resultados no deben interpretarse como prueba de una mejora de la productividad agrícola.