Desarrollo de alfalfa con resistencia combinada a herbicidas mediante la edición simultánea de tres genes con Prime Editing
Antecedentes
La alfalfa (Medicago sativa), conocida como la reina de los forrajes, es un cultivo perenne de la familia de las leguminosas ampliamente cultivado como fuente de proteína para la ganadería. Posee un alto valor forrajero debido a su equilibrada composición de aminoácidos y su riqueza en vitaminas y minerales. Sin embargo, en el cultivo protegido es vulnerable a la invasión de diversas malezas, lo que provoca una reducción en el rendimiento y la calidad. En las etapas iniciales de crecimiento, la competencia con las malezas por luz, agua y nutrientes suele impedir la formación de colonias estables.
El medio más eficiente para el control de malezas es la aplicación de herbicidas. En el caso del alfalfa, existe una absoluta escasez de variedades cultivadas con resistencia a herbicidas comerciales aprobada. Para controlar tanto las malezas gramíneas como las de hoja ancha que invaden los campos de monocultivo, es necesario combinar múltiples herbicidas con diferentes mecanismos de acción. Las variedades existentes de alfalfa presentaban alta sensibilidad a los herbicidas, por lo que un pequeño error en la aplicación podía causar graves daños fitotóxicos. Aunque se intentaba introducir rasgos dirigidos, la compleja estructura genética propia de las plantas tetraploides hacía difícil conferir resistencia múltiple en un corto plazo mediante el mejoramiento convencional por cruzamiento. Este fue el contexto que hizo urgente la necesidad de técnicas de mejoramiento molecular de precisión basadas en la edición génica.
Hallazgos clave
El equipo de investigación diseñó una plataforma de Prime Editing (PE) que optimiza la eficiencia de expresión en las células de alfalfa, logrando editar simultáneamente tres genes objetivo presentes en el genoma del cultivo.
Los genes diana como blancos de corrección fueron el gen MsALS1 y el gen MsALS2 de la acetolactato sintasa, así como el gen MsACC1 de la acetil-CoA carboxilasa. Con base en los resultados previos de estudios sobre los genes homólogos del arroz (rice), se diseñaron mutaciones que confieren resistencia a las sulfonilureas y otros compuestos relacionados en los genes MsALS1 y MsALS2. Parece que ha sido diseñado para resistir el control con nicosulfuron, utilizado principalmente en campos de cultivo de maíz y soja. También se planificó una mutación puntual precisa en el gen MsACC1 para conferir resistencia a los herbicidas de la clase ariloxifenoxipropionato (APP).
Para editar los tres genes en un solo transformante, se introdujo el sistema de nucleasa Csy4, una enzima de procesamiento de ARN derivada de bacterias. El principio consiste en expresar un transcrito de múltiples pegRNA conectados mediante secuencias de reconocimiento Csy4, de modo que la proteína Csy4 escinde cada ARN en unidades precisas para formar múltiples complejos. A través de este sistema, se realizaron con precisión las sustituciones de bases deseadas en los tres genes de la alfalfa. Las líneas de alfalfa editadas con mutaciones establecidas mantuvieron un crecimiento normal en pruebas de invernadero tras la aplicación combinada de nicosulfurón y haloxyfop-P-metil (un herbicida de la familia APP).
Significado y perspectivas
Este resultado, que logra la sustitución precisa de tres genes en una sola célula sin carecer de deleciones fuera del objetivo (off-target), se considera un ejemplo que ha derribado las barreras del fitomejoramiento molecular en cultivos perennes tetraploides. En cultivos con un alto número de juegos cromosómicos y variaciones genéticas complejas como la alfalfa, el uso de tijeras genéticas convencionales que inducen rupturas de doble cadena (DSB) suele provocar deleciones inesperadas o reordenamientos cromosómicos. Este estudio demuestra que, al combinar el método PE (que sobrescribe directamente la secuencia de bases) con un sistema de múltiples objetivos, es posible inducir el genotipo deseado minimizando el daño genómico.
A nivel de la finca, esto permitirá un control personalizado mediante la combinación selectiva de herbicidas para gramíneas (haloxyfop-P-metil) y herbicidas de amplio espectro (para dicotiledóneas y gramíneas) (nicosulfuron). Esto amplía las posibilidades de implementar sistemas de control cruzado sin dañar el cultivo cuando surgen malezas resistentes.
Sin embargo, aún quedan muchos desafíos por superar hasta la fase de validación del embalaje. Es necesario determinar si persisten casetes de expresión exógena utilizados en el proceso de transformación y establecer medidas para prevenir la transferencia de genes mediante la polinización. Dado que las normativas sobre cultivos editados con genes varían según el país, la obtención de líneas sin transgenes (null-segregants) y la verificación del rendimiento y el valor nutricional determinarán el calendario de comercialización.
Alfalfa (Medicago sativa) is the most widely cultivated forage crop worldwide, owing to its high protein content, balanced amino acid profile, and abundance of vitamins and minerals. However, weed infestation severely threatens alfalfa yield and quality. The lack of herbicide‑resistant cultivars, combined with the diversity of weed species, has made herbicide tolerance a key breeding objective. To address this challenge, we developed a highly optimized prime editing system and, for the first time, achieved prime editing in alfalfa by enhancing the expression efficiency of its components. Specifically, we introduced mutations in three target genes MsALS1, MsALS2 and MsACC1 to confer herbicide resistance: mutations in MsALS1 and MsALS2 were designed to confer resistance to ALS‑inhibiting herbicides (based on evidence from their rice homologs), while those in MsACC1 were targeted to confer resistance to aryloxyphenoxypropionate (APP) herbicides. Using the Csy4 nuclease system, we performed simultaneous prime editing of all three genes, ultimately generating alfalfa lines resistant to nicosulfuron and haloxyfop‑P‑methyl. This study represents the first successful multi‑gene prime editing in alfalfa, providing a novel tool and a valuable approach for alfalfa molecular breeding.
Esta investigación constituye un impulso práctico para aumentar la productividad de los grandes campos de cosecha de alfalfa y de las granjas comerciales de producción de forraje. En los campos de alfalfa existentes, el control inicial de malezas requería arar previamente el terreno o depender de herbicidas selectivos limitados, lo que implicaba una mayor carga laboral y costos elevados por el uso de agroquímicos. Con la introducción de estas líneas de resistencia combinada, se podrá aplicar de manera flexible en los campos de alfalfa las combinaciones de herbicidas que ya se utilizan en cultivos de arroz o maíz.
Esto evitará la caída en el contenido de proteína bruta del forraje que ocurre cuando se pierde la ventana de control tras la germinación, y maximizará la eficiencia de la cosecha mecanizada. Además, el protocolo de Prime Editing múltiple proporciona una base tecnológica aplicable de inmediato al fitomejoramiento molecular de otros cultivos para mejorar rasgos complejos como la resistencia a la sequía, la prevención del encamado o la reducción del contenido de lignina de forma simultánea.