Antecedentes

La tecnología CRISPR-Cas9 de tercera generación funcionaba mediante la ruptura completa de la doble cadena de ADN objetivo. Este proceso activaba la vía de reparación de unión de extremos no homólogos (NHEJ), lo que frecuentemente causaba deleciones o inserciones aleatorias no deseadas. Especialmente al intentar introducir genes terapéuticos de varios kilobases (kb) o corregir variaciones estructurales como inversiones o translocaciones cromosómicas, existía el riesgo constante de roturas cromosómicas o deleciones masivas debido a errores en la unión de los extremos cortados.

Para reducir estos efectos secundarios, surgió la tecnología de edición prima (Prime Editing, PE) combinada con transcriptasa inversa, pero las plataformas iniciales se limitaban a micro-ediciones de unas pocas decenas de pares de bases. A pesar de su ventaja de registrar secuencias de ADN externas en la posición objetivo sin romper la doble cadena, presentaba limitaciones físicas claras para la inserción de genes grandes o la remodelación cromosómica. Las plataformas complejas que integran enzimas recombinantes también se han topado con barreras como la disminución de la eficiencia de reconocimiento de los sitios de unión o el exceso de capacidad de carga de los vectores, lo que ha impedido que aceleren su entrada en la clínica.

Hallazgo clave

La plataforma Prime Assembly, informada recientemente, supera directamente las limitaciones de las variaciones estructurales del genoma. Los investigadores emplearon una estrategia que combina con precisión complejos de edición prima manipulados y múltiples ARN guía de edición prima (pegRNA) para formar simultáneamente múltiples puntos de unión específicos. Esto permite realizar ingeniería cromosómica —como invertir (inversión), duplicar (duplicación) o cambiar de posición (translocación) secuencias objetivo de decenas de kilobases— sin necesidad de ADN donante externo y sin cortes de doble cadena.

Según los datos experimentales, en líneas celulares humanas y modelos de células inmunitarias primarias, la eficiencia de la corrección de inversiones de ADN de más de 20 kb aumentó aproximadamente 3,8 veces en comparación con la edición TwinPE (Twin Prime Editing) convencional. La tasa de corte fuera de objetivo (off-target) y de ruptura cromosómica medida durante la inducción de translocaciones intercromosómicas registró una disminución de más del 95% respecto al grupo tratado con Cas9. Gracias al diseño de múltiples pegRNA que actúan de forma complementaria, las deleciones no deseadas de fragmentos que se producían ante la pérdida de un único objetivo se redujeron a menos del 1%.

Significado y perspectivas

Prime Assembly ha abierto la posibilidad de un tratamiento curativo para enfermedades genéticas causadas por variaciones estructurales complejas, como la inversión de 140 kb que provoca la hemofilia A o la gran deleción de exones en la distrofia muscular de Duchenne (DMD). Al minimizar la toxicidad por corte, se prevé que la seguridad en los procesos de fabricación de terapias celulares basadas en células madre hematopoyéticas o células madre pluripotentes inducidas (iPSC) se fortalezca significativamente. En el campo de la biología sintética, también se anticipa un diseño genómico preciso que permita reordenar grupos de genes de rutas metabólicas a gran escala de una sola vez.

No obstante, queda pendiente el desafío de optimizar los sistemas de administración in vivo para la aplicación clínica. Es necesario establecer sistemas que permitan la entrega segura a las células mediante la carga compartida de múltiples factores accesorios y ARN guía en nanopartículas lipídicas no virales (LNP) o virus adenoasociados (AAV), además de continuar las investigaciones sobre el seguimiento de mutaciones fuera del objetivo relacionadas con la persistencia de la expresión in vivo y el almacenamiento a largo plazo.