CRISPR administrado con LNP muestra menos inserciones en el sitio diana y riesgo de variantes fuera del objetivo
Antecedentes: elección del vehículo y evaluación de variantes fuera del objetivo
En músculo de ratón, CRISPR-Cas9 administrado mediante nanopartículas lipídicas (LNP) produjo una menor proporción de inserciones en el sitio diana que la administración con virus adenoasociado (AAV). Sin embargo, en células humanas se observó una frecuencia elevada de variantes fuera del objetivo asociadas con un ARN guía (gRNA) específico. El equipo de investigación presentó un marco para evaluar estos riesgos que combina predicciones computacionales, ensayos de corte de ADN y análisis de variantes en células.
El estudio se centró en el exón 45 del gen de la distrofina en la distrofia muscular de Duchenne (DMD). La estrategia emplea dos gRNA para inducir el salto de exón y restaurar el marco de lectura de la proteína. Las LNP encapsulaban ARN mensajero (mRNA) de Cas9 y ambos gRNA. Se espera que un método que no administra ADN reduzca el riesgo de inserción de fragmentos de ADN del vector. Aun así, es necesario evaluar por separado el riesgo de que Cas9 corte sitios distintos del objetivo.
Hallazgos principales: análisis de inserciones en ratones y 11 candidatos en células humanas
El experimento en ratones utilizó un modelo reportero, con cuatro animales por grupo. El diseño consistió en administrar una dosis en el gastrocnemio izquierdo, aplicar la misma dosis en el gastrocnemio derecho 28 días después y analizar ambos tejidos 28 días después de la segunda administración. Las proporciones de lecturas que contenían inserciones o deleciones (indels) fueron del 3,60% y el 3,55% tras la primera y la segunda administración de LNP, respectivamente, y del 10,29% y el 0,68% tras las administraciones correspondientes de AAV. Como la administración repetida se realizó en el músculo contralateral, estos resultados no pueden extrapolarse a la readministración en el mismo músculo ni a los efectos del tratamiento en pacientes.
La proporción de lecturas con inserciones fue del 0,51% tras cada administración de LNP y del 5,69% tras la primera administración de AAV. Entre las inserciones de más de 10 pares de bases cuyo origen se rastreó, más de la mitad de las observadas con LNP coincidían con la secuencia del exón 45 humano de DMD incluida en el reportero. Se informó que las secuencias derivadas del mRNA de Cas9 o de los gRNA apenas se detectaban; esto no demuestra la ausencia absoluta de secuencias foráneas.
Para el análisis fuera del objetivo, los investigadores compararon 13 herramientas de predicción. Después integraron las predicciones basadas en secuencia de Cas-OFFinder, CIRCLE-seq, que localiza sitios de corte de ADN in vitro, y la secuenciación del genoma completo (WGS) de dos líneas de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) humanas con cariotipos normales. Ambas líneas procedían de la misma persona sana y se trataron con una dosis alta de LNP para aumentar la sensibilidad de detección. Se definieron como «agrupaciones de indels» las regiones con tres o más patrones de indel distintos superpuestos, con el objetivo de distinguir variantes candidatas relacionadas con la edición de las que surgen espontáneamente durante el cultivo.
El análisis integrado identificó 11 candidatos fuera del objetivo, 10 de ellos asociados con el gRNA #23. La secuenciación dirigida de amplicones detectó una frecuencia de indels del 58–85% en uno de los sitios candidatos del cromosoma 9. Se trata de la frecuencia combinada de inserciones y deleciones medida en un sitio específico de iPSC tratadas con una dosis alta de LNP. No representa la frecuencia de inserciones por sí sola ni la tasa de efectos adversos en pacientes.
Implicaciones y perspectivas: la evaluación preclínica de seguridad requiere validación cruzada
Las herramientas de predicción no lograron aumentar a la vez la sensibilidad y la precisión. Esto explica la necesidad de distinguir y contrastar los candidatos computacionales, los cortes in vitro y las variantes que se producen en células. Los patrones de variantes fuera del objetivo también diferían entre las iPSC y las células humanas de linaje muscular, y la reproducibilidad de la detección entre condiciones fue limitada.
Incluso la WGS con una profundidad media de aproximadamente 60–80× no permite detectar todas las variantes de baja frecuencia. En regiones repetitivas, los errores de alineamiento de secuencias también pueden afectar la identificación de candidatos. Las dosis de LNP y AAV no se igualaron rigurosamente en términos molares, por lo que se requiere cautela al generalizar las diferencias entre vehículos de administración.
Este estudio aporta una base para considerar conjuntamente la elección del vehículo y la evaluación de los riesgos específicos de cada gRNA. La eficacia en pacientes, la seguridad a largo plazo y el cumplimiento de los requisitos de aprobación regulatoria siguen pendientes de validación. El diseño y los resultados del estudio se publicaron en el artículo de Molecular Therapy Nucleic Acids.
Ensuring the safety of CRISPR-Cas9 genome editing requires comprehensive assessment of off-target mutagenesis, particularly for therapeutic applications under regulatory review. DNA-free lipid nanoparticle (LNP) delivery is expected to minimize insertional risks compared to adeno-associated virus (AAV) vectors, but experimental validation has been limited. Here, on-target amplicon sequencing in mouse muscle demonstrated insertions largely derived from host genomic sequences, with no detectable AAV or transgene integration. Benchmarking 13
Los equipos que desarrollan tratamientos de salto de exón para la DMD deben evaluar tanto los riesgos de inserción asociados con el vehículo de administración como los riesgos de variantes fuera del objetivo asociados con cada gRNA. Este estudio ofrece un ejemplo de un método que identifica un conjunto amplio de candidatos con herramientas de predicción, distingue los cortes de las variantes mediante CIRCLE-seq y WGS en células humanas, y después verifica los candidatos con análisis dirigido de amplicones. La alta frecuencia de indels en un sitio aporta una base para reconsiderar la selección del gRNA y los sitios que requieren validación posterior. Sin embargo, como los patrones de variantes diferían según el tipo celular, aún se requieren pruebas en células humanas pertinentes para el tejido que se desea tratar. La baja proporción de inserciones con LNP, por sí sola, no permite juzgar la seguridad del proceso completo de edición.