Diseño de edición genética múltiple y precisa mediante el uso del mecanismo de procesamiento de tRNA
Antecedentes
La corrección de bases y la corrección por priming permiten sustituir o insertar/eliminar secuencias cortas sin cortar directamente la doble hebra de ADN. A medida que su aplicación se ha ampliado desde la corrección de mutaciones únicas hasta modelos de enfermedades poligénicas y genómica funcional, se ha requerido un sistema de expresión de gRNA que pueda dirigirse simultáneamente a múltiples loci genómicos.
Los métodos de edición múltiple existentes suelen incluir promotores individuales para cada gRNA o secuencias adicionales y enzimas para cortar gRNAs individuales de una transcripción larga. A medida que aumenta el número de objetivos, también lo hacen la complejidad de la construcción de ADN y el proceso de ensamblaje. Además, se presentan obstáculos como la capacidad de carga de los vectores, la variabilidad en la expresión de las gRNAs y la toxicidad celular. En particular, Cas9 no puede procesar por sí mismo gRNAs transcritos en forma de matriz, a diferencia de Cas12a, lo que requiere un mecanismo adicional de separación.
Hallazgo clave
El diseño de matriz DAP (drive-and-process) propuesto por el equipo de investigación es una estructura modular que alterna unidades de gRNA y ARN de transferencia (tRNA). Una vez transcrita, la maquinaria endógena de procesamiento de tRNA en la célula corta cada tRNA, liberando las gRNAs individuales que se unen al editor basado en Cas9 para reconocer múltiples objetivos simultáneamente. El punto clave del diseño es que no se requiere la adición de enzimas externas para cortar el ARN.
Este artículo no presenta un estudio sobre la eficacia terapéutica de la tecnología DAP, sino que organiza los principios de diseño y los pasos experimentales necesarios para implementar la edición múltiple por corrección de bases y corrección por priming en células humanas. Se presentan ejemplos con células HEK293T que incluyen la composición, fabricación, introducción celular y evaluación de los resultados de edición. En estudios básicos, se aplicó un tRNA humano de cisteína de 75 nucleótidos para editar simultáneamente hasta 31 objetivos de corrección de bases y hasta 3 objetivos de corrección por priming.
La matriz DAP permite reemplazar y reensamblar las gRNAs objetivo, y también se puede ampliar para procesar otros ARN de tamaño similar a las gRNAs, como los ARN de pelo de alce (shRNA). Esto permite diseñar experimentos de perturbación genética combinada que regulen tanto la corrección de secuencias de ADN como la supresión de la expresión génica desde una sola transcripción.
Significado y perspectivas
Este protocolo proporciona un punto de partida para reproducir y optimizar la edición múltiple precisa en el laboratorio. Es especialmente útil para crear modelos celulares de enfermedades cardiovasculares, metabólicas y musculares, donde múltiples mutaciones interactúan, o para investigar interacciones genéticas. Su estructura modular corta y repetitiva también ofrece ventajas al diseñar vectores con capacidad de carga limitada, como los virus asociados a adenovirus (AAV) o los lentivirus.
Sin embargo, el hecho de que funcione en células cultivadas no implica automáticamente su viabilidad terapéutica. A medida que la matriz se alarga, se dificultan la síntesis y clonación, y la cantidad de procesamiento y eficiencia de edición de cada gRNA puede variar según la secuencia objetivo y el tipo celular. Al manipular múltiples loci simultáneamente, es necesario evaluar no solo los efectos off-target individuales, sino también combinaciones de edición inesperadas y cambios en la función celular. La validación de la eficacia de transducción, seguridad a largo plazo y estabilidad de la matriz en células primarias y modelos animales sigue siendo crucial para su expansión clínica.
Los avances recientes en tecnologías de edición de bases y edición por priming han ofrecido a los investigadores una amplia gama de opciones para introducir inserciones, eliminaciones o sustituciones precisas en loci genómicos objetivo. Las aplicaciones de estos editores precisos se han expandido rápidamente al modelado y tratamiento de enfermedades poligénicas, así como a la creciente área de la genómica funcional. Esto ha generado la necesidad de sistemas compactos y modulares de expresión capaces de producir múltiples gRNAs (ARNg) a partir de una sola transcripción, manteniendo una alta eficiencia de edición. Para abordar este desafío, hemos desarrollado la matriz DAP (drive-and-process), una arquitectura modular compuesta por unidades alternadas de gRNA y tRNA. El diseño de la matriz DAP aprovecha la maquinaria endógena de procesamiento de tRNA de la célula para cortar cada tRNA de la matriz y liberar gRNAs individuales, lo que permite la edición simultánea en múltiples loci tras la hibridación con Cas9. Aquí, presentamos consideraciones clave de diseño y pasos experimentales necesarios para construir y desplegar matrices DAP como herramientas de edición múltiple de bases o edición por priming en células humanas (por ejemplo, HEK293T). También destacamos cómo la matriz DAP puede aprovecharse para procesar eficientemente gRNAs junto con otros ARN de tamaño similar, como los shRNA, posiblemente ampliando su uso en la resolución de preguntas biológicas complejas y aplicaciones terapéuticas que requieran perturbaciones genéticas coordinadas.
Las empresas farmacéuticas y biotecnológicas pueden utilizar la matriz DAP para introducir múltiples variantes patogénicas en la misma célula y crear modelos de enfermedades genéticas complejas. Por ejemplo, se pueden reproducir combinaciones de alelos de riesgo encontradas en poblaciones de pacientes en líneas celulares, y luego comparar respuestas y toxicidades a medicamentos. En estudios de genómica funcional, se pueden corregir simultáneamente múltiples genes candidatos o inhibir algunos mediante shRNA para explorar relaciones de letalidad sintética y combinaciones de dianas terapéuticas. Para desarrollar aplicaciones terapéuticas reales, será necesario cuantificar las tasas de edición y cambios transcripcionales por objetivo en células de pacientes, y optimizar conjuntamente la longitud de la matriz y la capacidad del editor dentro de un solo vector.