Herramientas de edición genética transportadas por vesículas extracelulares reducen ATXN3 en modelos de ataxia espinocerebelosa
Antecedentes
La ataxia espinocerebelosa tipo 3 (SCA3) es una enfermedad neurodegenerativa autosómica dominante en la que la expansión de repeticiones CAG en el gen ATXN3 da lugar a una proteína ataxina-3 tóxica. El equipo de investigación cargó herramientas de edición genética en vesículas extracelulares (VE) y las administró a células derivadas de pacientes y a dos modelos murinos; observó una reducción de la expresión de ATXN3 y edición en el sitio diana.
Para inactivar un gen causante de enfermedad con CRISPR-Cas9, las herramientas de edición deben entrar en las células diana. También hay que considerar la posibilidad de que la enzima editora persista durante mucho tiempo. Por ello, este estudio se centró en la administración transitoria de un complejo de ribonucleoproteína (RNP) formado por la proteína Cas9 y un ARN guía único (sgRNA).
Hallazgos principales
El equipo unió a SpCas9 una señal de palmitoilación que promueve la unión de ácidos grasos y la proteína enlazadora fotoclivable PhoCl para incorporarla a las VE. El diseño permite separar Cas9 de la señal de empaquetamiento al exponer las VE aisladas a luz de 410 nm antes de administrarlas. La luz se aplica a las VE aisladas y Cas9 se separa de la señal de empaquetamiento dentro de las VE.
La diana de edición fue el exón 2 de ATXN3. En lugar de restaurar la longitud normal de las repeticiones CAG, este enfoque inactiva la función del gen y no distingue entre los alelos normal y mutante. Para aumentar la entrada en las células, se utilizaron VE que expresaban en su superficie la glucoproteína de la envoltura viral VSV-G. A las 72 horas del tratamiento de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) derivadas de pacientes, la proteína ATXN3 mutante había disminuido una media del 28,58 % y la normal, del 21,21 %, frente al control con solución salina tamponada con fosfato (PBS).
También se obtuvieron resultados en dos modelos murinos, aunque se emplearon medidas de evaluación distintas. En un modelo estriatal que expresaba ATXN3 mutante y un reportero luminiscente, se inyectaron VE directamente en el cerebro y se midió la luminiscencia normalizada dos semanas después. El valor fue, en promedio, un 34,42 % menor que en el hemisferio de control, al que se habían inyectado VE con Cas9 pero sin sgRNA. En el modelo YAC SCA3 84.2, portador del gen humano ATXN3, se inyectaron conjuntamente en el cerebelo VE y un vector lentiviral que expresaba la proteína verde fluorescente (GFP). Cuatro semanas después, se observó una edición de hasta el 15,6 % en el sitio diana en células GFP positivas seleccionadas. Esta cifra no representa la tasa de edición en todo el cerebelo.
Implicaciones y perspectivas
Estos resultados constituyen una prueba de concepto preclínica de que las VE pueden administrar herramientas de edición de forma transitoria e inactivar parcialmente ATXN3. No pueden interpretarse como una demostración de mejoría de los síntomas motores ni de beneficio terapéutico en pacientes. También disminuyó la proteína normal, y sigue siendo un reto la distribución limitada de las VE después de su inyección directa en el cerebro.
La administración transitoria no demuestra la seguridad del método. En una evaluación inicial de efectos fuera de la diana, realizada tras introducir plásmidos de SpCas9 y sgRNA en células, uno de los cuatro sitios previstos mostró un nivel de inserciones y deleciones aproximadamente un 2,4 % superior al fondo del control. Los investigadores señalaron expresamente que se necesita una evaluación más exhaustiva. Esta evaluación debe distinguirse de un estudio integral de seguridad en animales tratados con VE.
El diseño y los resultados del estudio se describen en el artículo original publicado en Biomaterials.
Spinocerebellar Ataxia Type 3 (SCA3) is a neurodegenerative disorder caused by an overexpansion of a CAG tract within the ATXN3 gene, leading to toxic properties of the ataxin-3 protein. Genome editing using CRISPR-Cas9 enzymes is a promising strategy to inactivate mutant ATXN3 alleles; however, in vivo delivery remains a challenge. Extracellular vesicles (EVs) are promising vehicles for delivering Cas9 and single guide RNA (sgRNA) ribonucleoproteins, minimizing genomic exposure to highly active endonucleases. In this study, researchers designed SpCas9 with a palmitoylation motif, enabling SpCas9 and sgRNA enrichment into EVs. The introduction of a photocleavable linker, PhoCl, allowed for the photo-inducible release of SpCas9 from the palmitoylation motif in EVs, increasing target engagement to ATXN3 in vitro. EVs loaded with SpCas9 ribonucleoproteins resulted in ATXN3 knockout in SCA3 patient-derived iPSCs and two SCA3 animal models. These findings highlight an innovative route for the transient delivery of gene editing tools, providing a promising therapeutic platform for the treatment of genetic diseases, including SCA3, as reported in Nature Medicine.
En la edición genética para enfermedades cerebrales, la clave no consiste solo en decidir qué cortar, sino también dónde y durante cuánto tiempo administrar las herramientas de edición. Este estudio presenta un método de producción y administración que consiste en cargar un complejo de proteína Cas9 y ARN en VE y separarlo de la señal de empaquetamiento mediante luz antes de la administración. Estudios posteriores podrían usar esta plataforma para comparar la distribución en el cerebro y las vías de administración, y evaluar los efectos de reducir la ATXN3 normal y la edición fuera de la diana. Aunque las herramientas de edición permanezcan solo de forma transitoria, los cambios resultantes en el ADN pueden persistir. Para valorar su utilidad como estrategia terapéutica, habrá que determinar si una administración menos invasiva llega a suficientes células diana y si los cambios moleculares se traducen en una mejoría de los síntomas.