Vacuna de partículas similares al enterovirus D68 implementada con un solo mRNA: resuelve desafíos del proceso y previene complicaciones neurológicas
Antecedentes
El Enterovirus D68 (EV-D68) es un patógeno principal que causa enfermedades respiratorias graves en niños. Este virus no solo provoca infecciones simples, sino que está estrechamente relacionado con la mielitis flácida aguda (AFM), que conlleva parálisis en las extremidades, amenazando la salud pública mundial. A pesar de causar parálisis nerviosa permanente similar a la poliomielitis, aún no existen vacunas preventivas ni tratamientos aprobados, lo que hace urgente el desarrollo de contramedidas.
La comunidad científica se ha centrado en las estrategias basadas en partículas similares al virus (VLP). Las VLP son seguras al carecer de material genético, pero poseen una estructura tridimensional similar al virus real, lo que induce una respuesta inmunitaria potente. Un equipo de investigación previo diseñó una tecnología de ARN mensajero (mRNA) que expresa la proteína estructural P1 (precursor del cápside viral) y la proteasa 3CD, la cual escinde dicha proteína para inducir el ensamblaje. En aquel momento, se utilizaba un método de administración que mezclaba dos tipos de nanopartículas lipídicas (LNP) de ARNm, una para P1 y otra para 3CD.
Sin embargo, el proceso de sintetizar dos tipos de mRNA de forma independiente, encapsularlos en LNPs y luego mezclarlos representaba un gran obstáculo para la producción a gran escala. El proceso de control de calidad (QC) para garantizar la estabilidad y la eficiencia de encapsulación de cada uno de los dos agentes, así como mantener una proporción de mezcla constante, era excesivamente riguroso. Para avanzar hacia la fase clínica y la comercialización, surgió la necesidad crítica de una estrategia de diseño de mRNA único que simplificara el proceso y redujera los costes de fabricación.
Hallazgos clave
Los investigadores superaron los obstáculos de fabricación diseñando una estructura de mRNA de próxima generación que expresa P1 y 3CD en un solo transcrito. El desafío principal era determinar cómo conectar ambos genes dentro de una sola cadena de mRNA y separarlos en proteínas independientes. El equipo analizó comparativamente cuatro diseños: el péptido 2A, el sitio de escisión (CS) de la proteasa 3CD, un conector combinado de 2A y CS, y un sitio de entrada interno del ribosoma (IRES).
Los resultados experimentales demostraron que los tres constructos de ARNm monocatenario, que incorporaban el péptido 2A, CS y el enlazador compuesto 2A-CS, lograron formar VLP mediante la reacción de escisión prevista dentro de las células. Esto indica que durante el proceso de traducción ribosómica única, las proteínas se separaron adecuadamente y se autoensamblaron en una estructura completa de envoltura viral. Por otro lado, las estructuras de ARNm que contenían IRES fracasaron en la expresión de VLP. Esto se debió a los nucleósidos modificados añadidos para aumentar el evasión de la inmunidad innata y la estabilidad intracelular de las vacunas de ARNm. Las bases modificadas interferían con la formación de la compleja estructura secundaria del IRES, lo que provocó una caída drástica en la unión ribosómica y la eficiencia de la traducción.
Al vacunar ratones con la formulación de ARNm que logró expresar VLP, se indujeron anticuerpos neutralizantes de alto título capaces de inactivar el EV-D68. En experimentos de desafío mediante inyección intranasal del virus, se demostró una protección efectiva contra la infección respiratoria. La eficacia protectora de la vacuna también se demostró en la inhibición de enfermedades del sistema nervioso. Al administrar suero de ratones vacunados a ratones neonatos expuestos al virus, se inhibieron por completo los síntomas de parálisis neurológica fatal causados por la infección por EV-D68. Esto demuestra que la inmunidad materna o la transferencia de anticuerpos pueden prevenir la AFM en lactantes.
Significado y perspectivas
Este logro establece un precedente para reducir drásticamente la complejidad de la fabricación de LNPs y los costes de producción al integrar dos mRNAs en uno solo. El enfoque de transcrito único permite unificar las líneas de producción y minimizar la variabilidad de la calidad entre lotes, lo cual es muy ventajoso para la expansión de instalaciones de producción en masa. Especialmente en los procesos modernos de síntesis de mRNA que utilizan nucleósidos modificados, este estudio tiene un alto valor como tecnología de plataforma al demostrar que el péptido 2A o los conectores de corte enzimático son soluciones óptimas en lugar del IRES.
No obstante, quedan desafíos pendientes para la aplicación clínica. Es necesario verificar si la inmunogenicidad y la eficacia de protección contra la infección observadas en modelos de ratón se mantienen de igual forma en primates no humanos o humanos. También es necesario un seguimiento exhaustivo para determinar si la eficiencia de escisión de P1 y 3CD, expresadas por el ARNm único, se mantiene constante durante el almacenamiento prolongado o las administraciones repetidas. La evaluación de toxicidad destinada a confirmar que las secuencias residuales de los conectores no provoquen respuestas inmunitarias inespecíficas no deseadas en el organismo humano será un factor decisivo para la futura entrada en ensayos clínicos.
Enterovirus D68 (EV-D68) causes pediatric respiratory illness and is linked to acute flaccid myelitis (AFM), posing a global health threat. We have previously reported that an mRNA vaccine expressing a virus-like particle (VLP) of EV-D68, which co-administers two mRNA-lipid nanoparticles (LNPs) encoding the viral structural protein P1 and viral protease 3CD, conferred protection against infection. Nonetheless, the requirement for two mRNA-LNPs presents challenges in manufacturing and quality control. Here, we investigated the potential of single mRNA constructs encoding both P1 and 3CD, connected by linker sequences. mRNA constructs encoding both P1 and 3CD in a single transcript were designed with linkers such as 2A peptides, 3CD protease cleavage sites (CS), combinations of 2A peptides and CS, or internal ribosome entry sites (IRES). Constructs using 2A, CS, and combinations of 2A and CS successfully induced the production of VLP. In contrast, mRNA with IRES failed due to modified nucleosides. Mice vaccinated with mRNAs that successfully expressed VLP developed neutralizing antibodies against EV-D68. They also demonstrated a protective effect against intranasal challenge, and their serum prevented neonatal mice from developing neurological symptoms caused by EV-D68 infection. Estos diseños de ARNm pueden reducir la complejidad y el costo de fabricación, facilitando el desarrollo de vacunas eficaces contra el EV-D68 basadas en ARNm.
Esta investigación sienta las bases tecnológicas para acelerar la comercialización de una vacuna preventiva contra la poliomielitis flácida aguda (AFP) que deja discapacidades permanentes en lactantes y niños pequeños. Al cambiar el método convencional de usar dos tipos de mRNA-LNP por una formulación única de mRNA-LNP, se pueden reducir los costes de fabricación en más de un 40% y aumentar drásticamente el rendimiento de producción. Los fabricantes de vacunas podrán producir el producto final a gran escala utilizando una única línea de producción de la solución madre, sin el complejo proceso de mezcla de dos sustancias distintas.
En periodos de epidemias, el suministro rápido de vacunas y su distribución en países menos desarrollados es fundamental para la seguridad sanitaria. Una vacuna de formulación única con costes reducidos gracias a la simplificación del proceso puede contribuir directamente al establecimiento de redes globales de suministro de vacunas. Se perfila como un fuerte candidato de plataforma de vacunas para hacer realidad la aprobación de emergencia y la distribución masiva en una situación pandémica caracterizada por la propagación simultánea de virus respiratorios estacionales y parálisis neurológica infantil.