AAV 유전자 치료, ECM이 장벽으로 작용한다는 새로운 증거
ECM, 유전자 치료의 장벽
세포외기질(Extracellular Matrix, ECM)이 아데노연관바이러스(AAV) 벡터의 확산과 유전자 도입을 제한할 수 있다는 시험관 내 연구 결과가 나왔다. 영향은 AAV 혈청형과 ECM의 유래 조직에 따라 달랐다. 환자의 치료 효과를 평가하거나 전달 장벽을 해결한 연구는 아니다.
AAV 기반 유전자 치료에서는 벡터가 표적 세포까지 도달해야 한다. 조직의 미세환경을 이루는 ECM은 입자의 이동을 물리적으로 방해하거나 입자와 결합해 전달을 제한할 가능성이 있다. 연구팀은 조직별 ECM 조성과 AAV 혈청형이 확산과 유전자 도입에 어떤 영향을 주는지 조사했다.
AAV 종류와 조직에 따라 달라진 확산·유전자 도입
연구팀은 AAV2, AAV6, AAV8을 형광 표지하고, 돼지 폐·간·소장 점막하조직에서 얻은 탈세포화 세포외기질(dECM) 수화젤에서 확산을 영상으로 추적했다. 비교군은 크기가 비슷한 20 nm 폴리에틸렌글리콜(PEG) 코팅 나노입자였다.
AAV6과 AAV8은 세 조직 유래 dECM 모두에서 비교 나노입자보다 확산이 유의하게 느렸다. AAV2는 폐·간 dECM에서는 확산이 유의하게 느렸지만, 소장 점막하조직 dECM에서는 나노입자와 유의한 차이가 없었다. 세 혈청형 중 AAV2의 확산이 가장 빨랐으며, AAV6과 AAV8의 상대적 순서는 조직에 따라 달라졌다.
유전자 도입은 A549 세포의 2차원 배양과 3차원 스페로이드 모델에서 평가했다. 농도 6 mg/mL의 폐 dECM을 덧씌운 2차원 배양에서 48시간 뒤 녹색형광단백질(GFP) 양성 세포 비율을 측정하자, AAV2와 AAV6은 dECM이 없는 조건의 약 절반으로 낮아졌다. 반면 AAV8에서는 같은 감소가 관찰되지 않았다. 다만 AAV8은 dECM이 없는 조건에서도 다른 두 혈청형보다 GFP 양성 세포 비율이 낮았다.
유전자 도입 세포의 비율과 세포당 GFP 형광 강도도 구분해야 한다. 폐 dECM 조건에서 생존 세포의 GFP 형광 강도는 AAV6에서 감소했지만 AAV2와 AAV8에서는 증가했다. 폐 dECM으로 둘러싼 3차원 스페로이드의 AAV6 실험에서는 생존 세포 중 유전자 도입 세포 비율과 세포당 GFP 형광 강도가 모두 감소했다. 이 결과를 세 혈청형 전체의 3차원 반응으로 일반화할 수는 없다.
ECM을 고려한 벡터 평가와 남은 과제
이 결과는 차세대 AAV 설계 시 ECM과의 상호작용을 고려해야 한다는 근거를 제공한다. 연구진은 크기가 비슷한 나노입자와의 차이를 바탕으로 ECM 결합이 확산 저하를 일부 설명할 수 있다고 해석했다. 특정 ECM 성분에 대한 결합량이나 확산 저하에서 유전자 도입 감소로 이어지는 인과관계를 직접 확정한 것은 아니다.
dECM 수화젤은 조직별 성분 차이를 비교하는 모델이며 생체 조직의 구조를 그대로 재현하지 않는다. 3차원 dECM 조건에서는 세포 생존율도 감소했고, 세포와 ECM의 상호작용에 따른 세포 특성 변화가 유전자 도입에 영향을 줬을 가능성이 남는다. ECM 결합을 줄이는 바이러스 외피 단백질 구조인 캡시드의 개량은 후속 연구 방향으로 제시됐으며, 장벽 극복이나 환자 치료 효과 개선은 이번 연구에서 검증하지 않았다.
출처: 연구 원문, 논문 DOI.
PURPOSE: The extracellular matrix (ECM) is a major component of the tissue microenvironment which may pose a barrier to the distribution of AAV in target organs, preventing delivery of therapeutic cargo. We sought to address this potential barrier to AAV gene therapy by furthering our understanding of AAV-ECM interactions. We hypothesized that both the AAV serotype and ECM composition will impact AAV transport and gene delivery. METHODS: AAV2, AAV6, and AAV8 viral vectors were fluorescently labeled to allow for visualization of their diffusion through the ECM. Lung, liver, and small intestinal submucosal dECM hydrogels were formulated as models of the ECM with tissue-specific biomolecular content. We then characterized AAV and nanoparticle diffusion within decellularized ECM using fluorescent video microscopy and multiple particle tracking. Additionally, we evaluated AAV transduction in dECM-incorporated 2D and 3D spheroid tissue culture models. RESULTS: All AAV displayed reduced diffusivity through ECM as compared to similarly sized nanoparticles. AAV2 diffusion was least affected by the presence of ECM across tissue types as compared to AAV6 and AAV8. AAV transduction in dECM incorporated CONCLUSIONS: These results suggest binding of AAV to the ECM may decrease their therapeutic effect in target tissues throughout the body. The barrier function of the ECM should be considered in development of AAV for gene therapy applications.
이 연구는 AAV 후보를 평가할 때 세포만 배양한 조건과 표적 조직 유래 ECM을 포함한 조건을 함께 비교할 근거를 제공한다. 예를 들어 폐 조직을 겨냥한 벡터를 시험한다면, 폐 dECM 안에서의 확산과 유전자 도입 세포 비율, 세포당 GFP 형광 강도를 나눠 측정하는 평가 설계를 검토할 수 있다. 이번 연구에서도 이 지표들은 항상 같은 방향으로 변하지 않았다. 확산이 느리다는 사실만으로 유전자 도입이나 발현 양상을 일괄 판단하기 어려운 이유다. 다만 이 시험관 내 결과만으로 환자에게 적합한 혈청형을 정하거나 임상 효능 개선을 예측할 수는 없다.