프라임 어셈블리 기술로 유전자 손상 없이 수 킬로베이스급 유전자 치료 물질 이식 성공
배경
인간 세포 내에서 대규모 유전자 조각을 교체하거나 삽입하는 기술은 유전체 교정 분야의 오랜 숙원. 기존 유전자 가위 기술은 수십 염기쌍의 미세 교정에 유용할 뿐, 정상 유전자 삽입 과정에서는 효율이 크게 떨어졌다. 대형 유전자를 이식하려고 이중 가닥 절단(Double-Strand Break, DSB)을 유도할 때 발생하는 유전독성이 큰 원인이다. 특히 세포 분열이 멈춘 분화 세포에서는 유전자 치료 물질 전달 자체가 불가능에 가까운 실정. 프라임 편집(Prime Editing, PE) 기술이 새로운 대안으로 떠올랐으나, 이 또한 삽입 가능한 크기가 수백 염기쌍 수준에 그쳤다. 이에 유전체 손상을 방지하면서도 큰 유전자 조각을 정밀하게 삽입할 수 있는 플랫폼 개발이 시급한 과제. 서울대학교 의과대학 배상수 교수 연구팀은 기존 프라임 편집기의 원리를 적용해 이러한 한계를 극복하는 새로운 접근법을 제시했다.
핵심 발견
연구팀은 프라임 편집기를 응용해 표적 유전체와 기증자(donor) DNA 양쪽에 각각 한 쌍 또는 두 쌍의 단일 가닥 3-말단 돌출부(3'-flap)를 생성하는 교정 기술을 구축하고, 이를 프라임 어셈블리(Prime Assembly, PA)라 명명했다. 이 3-말단 돌출부는 서로 완벽하게 맞물리도록 설계되어 시험관 내에서 여러 DNA 조각을 조립하는 기브슨 어셈블리(Gibson Assembly) 기법처럼 세포 안에서 정밀한 결합을 유도하는 기전. 이 기술을 활용해 백만 염기쌍(Mb) 단위의 유전체 영역을 편집하거나 킬로베이스급 유전자를 원하는 부위에 정확히 이식해 냈다. PA는 1.0에서 6.5킬로베이스(kb) 크기의 플라스미드 DNA와 선형 이중 가닥 DNA를 모두 기증자 유전자로 유입하는 넓은 범용성이 특징. 연구팀은 인간 배아 신장세포(Human Embryonic Kidney 293T, HEK293T)에서 2.9kb 크기의 기증자 DNA 조각으로 표적 유전체 부위를 교체하는 실험을 진행했다. 이 실험에서 최대 57.8%의 교체 효율을 입증한 것은 물론, 삽입된 DNA 조각의 정확도 역시 90%를 초과하는 수치. 더 나아가 인간 일차 T 세포(primary human T cell)에 키메라 항원 수용체(Chimeric Antigen Receptor, CAR) 유전자를 특정 부위에 이식하는 실험에서도 28.1%의 삽입 효율을 거뒀다. 마우스 모델에 녹색 형광 단백질(Green Fluorescent Protein, GFP) 유전자를 탑재한 PA를 수압체 전달(hydrodynamic injection) 방식으로 체내에 주입했을 때, 간세포에서 관찰된 유전자 삽입 효율은 평균 4.3% 수준. 이는 시험관 수준의 세포 연구를 넘어 실제 동물 체내 조직에서도 대형 유전자 삽입이 기능함을 입증한 결과로 평가된다. 기존 공법들과 달리 유해한 돌연변이 부산물을 거의 형성하지 않는다는 점도 눈길을 끈다.
의미와 전망
기존의 유전자 삽입 기술은 세포 독성과 표적 외 삽입(off-target integration) 등의 위험 요인으로 인해 실제 치료제 적용 단계에서 제동이 걸리는 흐름. PA는 이중 가닥 절단 없이 유전자를 결합하므로 돌연변이나 비정상적인 전위 반응을 배제해 안전성 확보에 기여할 것으로 보인다. 유전체 전반을 교정해야 하는 희귀 유전 질환 치료제 개발에 유용한 수단이 마련된 셈이다. 다만 동물 실험에서 나타난 간세포 유전자 삽입 효율이 4.3%에 머문 만큼, 치료 효과를 극대화하려면 효율 개선 연구가 뒤따라야 할 터. 지질나노입자(Lipid Nanoparticle, LNP)나 아데노부속바이러스(Adeno-Associated Virus, AAV)와 같은 전달체 기술을 고도화해 생체 내 전달 효율을 극대화하는 과제가 남았다.
Replacing large-scale fragments in human cells remains a substantial challenge. Here, we present a programmable gene replacement tool, named prime assembly (PA), which adapts prime editors to produce one or two pairs of 3'-flaps on both the genome and donor DNA. These 3'-flaps anneal to each other precisely, similar to Gibson assembly in DNA oligonucleotides, allowing megabase-scale genomic excision and/or kilobase-scale donor insertion at the gene of interest. PA accepts DNA plasmids and linear double-stranded DNA as donors, ranging from 1.0 to 6.5 kb in size. We demonstrate an efficiency of up to 57.8% in replacing endogenous sequences with a 2.9-kb donor DNA fragment in HEK293T cells, with an accuracy of >90% for integrated PA fragments. Furthermore, PA enables site-specific chimeric antigen receptor integration with up to 28.1% efficiency in primary human T cells. When PA containing a GFP donor is delivered to mice by hydrodynamic injection, an average integration efficiency of 4.3% is measured in GFP-positive hepatocytes.
PA 기술은 임상 현장에서 체외(ex vivo) 세포 치료제 제작 공정을 단순화하는 데 기여할 상당한 잠재력을 지녔다. 차세대 면역항암제인 CAR-T(Chimeric Antigen Receptor T) 세포 치료제를 제작하는 공정이 대표적인 적용 시나리오. 기존에는 환자의 T 세포에 CAR 유전자를 도입하려고 렌티바이러스를 활용했으나, 유전체가 무작위로 끼어들어 암을 유발하는 부작용 위험이 있었다. 반면 PA는 특정 부위에 정확하게 CAR 유전자를 안착시키므로 안전하고 효능이 일관된 치료제를 양산하는 기반을 제공한다. 임상 연구에서 T 세포 교정 효율 28.1%를 기록한 것은 비바이러스성 CAR-T 치료제 상용화에 중요한 이정표. 아울러 산업적으로도 대형 플라스미드와 선형 DNA를 유연하게 활용하므로, 생산 단가를 절감하고 제조 공정을 단순화하는 이점을 안겨줄 전망이다.