PE-STAR, DNA 복구 조절과 SOS 기반 선별로 대장균 프라임 에디팅 효율 개선
박테리아 프라임 에디팅의 한계
프라임 에디팅은 DNA 이중가닥 절단 없이 유전자를 정밀하게 수정하는 기술이다. 연구팀은 대장균에서 DNA 복구 조절과 편집 세포 선별을 결합한 PE-STAR를 개발해 특정 편집 조건에서 약 80–90%의 편집 효율을 보고했다. 이 수치는 선택 후 집단에서 원하는 편집이 차지하는 비율을 나타낸다.
박테리아에서는 편집 중간체를 처리하는 효소와 복구 경로가 편집 결과에 영향을 미친다. 기존 접근은 효율이 낮거나 수정 가능한 서열 길이가 제한적이었다. 연구팀은 대장균 MG1655에서 세 엑소뉴클레아제 유전자 sbcB, exoX, xseA를 제거한 ES95 균주를 바탕으로 PE-STAR를 구축했다.
복구 경로 보강과 SOS 기반 선별
세 효소를 제거하면 역전사로 만들어진 편집 DNA 가닥의 분해를 줄일 수 있다. 연구팀은 형질전환 후 배양 시간을 늘리고 RecJ 효소도 과발현시켰다. 저자들은 RecJ가 경쟁하는 비편집 가닥의 5′ 방향 처리를 강화해 편집 가닥의 유전체 반영에 유리한 조건을 만든다는 모델을 제시했다.
편집 세포의 비율을 높이기 위해 DNA 손상에 반응하는 SOS 회로도 도입했다. 두 DNA 가닥에 각각 단일가닥 절단을 만드는 PE3를 LexA 조절 가이드 RNA 발현과 연결하고, MAD7 핵산분해효소가 독소 CcdB 유전자를 가진 역선택 플라스미드를 제거하도록 설계했다. 이후 독소 발현을 유도하면 플라스미드를 유지한 미편집 세포를 줄이는 방식이다. 이 과정에서 높아지는 편집 비율을 편집 세포의 생존 확률로 해석해서는 안 된다.
효율은 편집 유형·길이·위치에 따라 달랐다. xylB의 단일 염기 삽입은 특정 조건에서 82.41%였고, 5 bp와 10 bp 삭제는 약 90%에 도달했다. 반면 10 bp 삽입은 0.44%에서 6.78%, 30 bp 삽입은 11.76%에서 27.40%로 개선됐다. 최대 46 bp의 삽입·삭제·교체를 지원했지만 모두 같은 효율을 보인 것은 아니다. galK와 lacZ에서는 기존 PE2 대비 최대 16배 향상이 관찰됐다. xylB의 효율은 선택 후 모은 콜로니의 표적 서열 분석으로, galK와 lacZ의 효율은 콜로니 색 표현형으로 평가했다.
대형 유전자 경로 통합과 남은 과제
긴 DNA 카세트의 삽입에는 별도의 재조합 단계를 사용했다. 먼저 PE-STAR로 염색체에 46 bp 길이의 attB 인식 부위를 설치한 뒤, Bxb1 인테그라제로 3.2 kb 녹색형광단백질(GFP) 카세트와 8.0 kb 리보플라빈 생합성 경로를 각각 통합했다. 선택 후 검사한 콜로니에서는 모두 정확한 통합이 확인됐다. 이 100%는 전체 투입 세포나 두 단계 전체의 성공률을 뜻하지 않는다.
리보플라빈 경로를 넣은 균주에서는 96시간 배양 중 배양 상등액의 리보플라빈 농도가 최대 3.23 mg/L로 측정됐다. 다만 세포 밀도 지표인 600 nm 광학밀도(OD600)는 대조군 3.27에서 경로 통합 균주 2.72로 낮아져 성장 부담도 관찰됐다. 이번 결과는 대장균에서 정밀 편집과 대사 경로 설치를 연결한 실험실 검증이다. 다른 세균에서의 성능과 산업 규모 생산성은 후속 검증 과제로 남는다.
연구 방법과 결과는 Nucleic Acids Research 논문 공개 본문에서 확인할 수 있다. DOI: 10.1093/nar/gkag285.
Prime editing enables precise genome modifications without DNA double-strand breaks, yet bacterial applications are limited by low efficiency and small edit sizes. Here, we develop PE-STAR, Prime Editing with SOS-Triggered and RecJ-Augmented Repair, to enhance prime editing in Escherichia coli. Removing three inhibitory 3'→5' exonucleases (SbcB, ExoX, and XseA) improved edited-strand retention, and extending post-transformation outgrowth increased editing efficiency. RecJ overexpression strengthened 5'-directed processing during flap resolution and gap expansion, biasing repair toward incorporation of the reverse-transcribed edited strand. To enrich edited cells, we integrated an SOS-responsive counter-selection circuit that links PE3-associated dual nicking to LexA-dependent gRNA expression targeting a plasmid encoding the toxin CcdB, thereby eliminating unedited cells. PE-STAR achieved up to 80%-90% editing efficiency for short-fragment modifications, representing up to 16-fold improvement across loci. The platform supported insertions, deletions, and replacements of up to 46 bp with high efficiency. Furthermore, installing an attB site by prime editing, followed by Bxb1 integrase recombination, enabled chromosomal integration of 3.2 and 8.0 kb cassettes with 100% recombination efficiency among screened colonies, including GFP reporter and riboflavin biosynthetic pathway. PE-STAR expands both the efficiency and functional scope of bacterial prime editing for programmable genome engineering.
고효율 박테리아 편집은 합성생물학과 바이오공정용 균주 설계에 유용한 도구다. 이번 연구는 작은 서열을 수정하는 프라임 에디팅과 긴 유전자 경로를 넣는 Bxb1 재조합을 연결했다. 연구자는 대장균 염색체에 attB 부위를 설치한 뒤 리보플라빈 같은 대사산물의 생합성 경로를 통합하고, 생산 여부와 성장 부담을 함께 평가할 수 있다. 다만 높은 편집 비율에는 선택 과정이 포함되며 삽입·삭제·교체의 성능도 다르다. 실제 균주 개발에서는 목표 편집과 위치에 맞춘 조건 확인이 필요하다. 리보플라빈 생산 검출은 경로의 기능을 보여주지만 상업 생산성이나 공정 경제성 개선을 입증한 결과는 아니다.