배경

벼의 기존 유전체 편집 도구를 최적화해 단백질 검출용 태그를 정확히 삽입한 개체 비율을 특정 표적에서 3배 높인 연구가 aBIOTECH에 실렸다. 핵심은 Tf1 역전사효소 변이체의 도입과 코돈 최적화다. 의도하지 않은 편집도 관찰돼 편집 정확성 전반이 개선됐다고 해석하기는 어렵다.

연구진이 앞서 개발한 뉴클레아제 매개 프라임 편집(NM-PE)은 SpCas9 절단효소와 미세상동성 매개 말단 연결(MMEJ) 기반 프라임 편집을 결합한 시스템이다. 식물의 내인성 유전자에 단백질을 식별하는 표지 서열을 삽입할 수 있지만, 상대적으로 긴 3 × FLAG 태그의 삽입 효율은 개선 과제로 남아 있었다. 이번 연구는 기존 시스템의 구성 요소를 바꿔 성능을 높이는 데 초점을 맞췄다.

핵심 발견

연구진은 기존 몰로니 생쥐 백혈병 바이러스(M-MLV) 유래 역전사효소를 포유류 PE6 시스템에서 사용된 Tf1 계열 변이체 evoTf1M4로 교체했다. 이어 같은 단백질을 암호화하되 코돈 사용을 달리한 구성체들을 비교했다. 코돈 최적화는 단백질의 아미노산 서열을 유지하면서 이를 암호화하는 염기서열을 조정하는 방식이다. 실험에는 벼 Kitaake 품종을 사용했으며, 아그로박테리움으로 편집 구성체를 도입한 독립적인 1차 형질전환체(T0)를 분석했다.

처음 만든 rPE20a에서는 시험한 세 유전자좌 모두에서 정확한 태그 삽입이 검출되지 않았다. 반면 옥수수의 코돈 사용에 맞춰 최적화한 rPE20aV3는 벼 실험에서 가장 높은 삽입 효율을 보였다. Tf1 변이체로 교체하는 것만으로 성능 향상이 보장되지는 않은 셈이다. 다만 이러한 차이를 설명하는 분자적 원인까지 입증한 결과는 아니다.

66염기쌍(bp) 길이의 3 × FLAG 서열을 삽입한 실험에서 rPE20aV3는 OsCPK6 표적의 T0 개체 48개 중 9개에서 정확한 삽입을 만들었다. 이 비율은 18.75%로, 기존 rPE14b의 48개 중 3개인 6.25%의 3배였다. 이는 전체 DNA 분자 중 편집된 비율이 아니라 정확한 삽입이 확인된 형질전환 개체의 비율이다. 다른 표적인 OsCPK3와 OsCPK4에서는 각각 7/48개체(14.6%), 5/48개체(10.4%)로 나타났다. 연구진은 염기서열 분석으로 삽입을 확인했고, 면역블롯에서는 태그를 붙인 단백질의 예상 분자량에 부합하는 신호를 검출했다.

점돌연변이 도입에는 별도 구성체 rPE20c를 사용했다. OsACCase에서는 비교 구성체 rPE14a로 검출되지 않던 정확한 편집이 rPE20c를 사용한 45개체 중 5개(11.1%)에서 확인됐다. 그러나 OsGS3에서는 rPE14a와 rPE20c 모두 7/48개체(14.6%)로 같았다. 성능 향상은 표적에 따라 달랐다.

의미와 전망

이번 성과는 벼의 내인성 단백질에 검출용 태그를 붙이는 기능유전체 연구 도구의 개선으로 해석할 수 있다. 정확한 삽입 개체 비율이 높아지면 후속 분석에 쓸 연구용 계통을 확보하는 데 도움이 될 가능성이 있다.

한계도 분명하다. 태그 삽입을 시험한 세 유전자좌 모두에서 작은 삽입·결실이나 불완전한 태그 삽입 등 비의도 편집이 관찰됐다. 태그 단백질 검출은 확인했지만 원래 단백질 기능이 보존됐다는 증거와는 구분해야 한다. 다른 품종·작물에서의 재현성, 후대의 안정성, 수량이나 내재해성 개선도 이번 결과만으로 판단할 수 없다. 실제 활용에는 표적별 최적화와 편집 계통의 개별 검증이 뒤따른다.

연구 결과와 실험 조건은 aBIOTECH 논문 원문에 제시돼 있다.