프라임 편집으로 아미노산 치환해 공유결합 약물의 세포 내 표적 규명하는 플랫폼 개발
배경
최근 바이오 의약품과 신약 개발 분야에서는 단백질의 특정 아미노산과 영구적으로 결합하는 공유결합 리간드(Covalent Ligand) 연구가 활발히 진행 중이다. 특히 화학 프로테오믹스(Chemical Proteomics) 기술이 발전하면서 수백 개의 인간 단백질에서 공유결합을 형성할 수 있는 시스테인(Cysteine) 잔기가 대규모로 발굴됐다. 그러나 이처럼 약물이 결합할 수 있는 아미노산 부위를 알아내더라도, 실제 세포 내부에서 결합이 일어났을 때 어떤 생리적 변화가 유도되는지 대규모로 확인하기는 매우 어렵다. 결합 부위가 실제로 질병 치료나 세포 사멸에 관여하는 진짜 작용점(Target)인지 혹은 단순히 결합만 하고 생물학적 활성에는 아무런 영향을 주지 않는 무의미한 부위인지 구별하기 힘든 탓이다. 기존에는 개별 단백질을 일일이 유전적으로 조작하여 세포에 주입하는 등의 복잡하고 비효율적인 방식을 거쳐야 했다. 이로 인해 수많은 공유결합 후보 물질이 발견되고도 실제 표적과의 상호작용 기전을 밝혀내지 못해 신약 개발 연구의 병목 현상이 발생해 왔다.
핵심 발견
이러한 한계를 해결하고자 연구진은 프라임 편집(Prime Editing) 기술을 접목한 신기술 플랫폼인 ESCAPE(Endogenous Site-specific Competition Assays using Prime Editors)를 개발했다. 이 플랫폼은 유전체 수준에서 아미노산 서열을 정밀하게 교정하는 프라임 편집을 활용해 세포 내부의 특정 시스테인 잔기를 세린(Serine) 잔기로 치환하는 방식이다. 아미노산이 세린으로 바뀌면 공유결합 리간드가 해당 단백질과 결합하지 못한다. 이후 연구진은 약물이 투여되었을 때 각 세포 집단의 생존율과 유전자형 분포를 분석하여 대립유전자 빈도 기반 저항성 점수를 정밀하게 분석해 냈다. 연구진은 활성 기반 단백질 프로파일링(Activity-Based Protein Profiling, ABPP) 기법으로 탐색한 50개 이상의 표적 단백질 내 시스테인 결합 부위를 대상으로 실험을 수행하였다. 연구 결과 암세포 성장을 억제하는 다수의 공유결합 상호작용을 선별하는 성과를 올렸다. 대표적인 검증 사례가 RNA 헬리케이스(RNA Helicase)의 한 종류인 DDX49 단백질의 특정 시스테인 잔기임이 밝혀졌다. 이 아미노산은 DDX49의 활성 부위가 아닌 비-오르토스테릭(Non-orthosteric) 결합 부위에 위치하고 있어 기존 연구에서 포착하기 어려웠다. 하지만 약물이 결합할 경우 세포 내 18S 리보솜 RNA(18S rRNA) 가공과 40S 리보솜 조립이 연쇄적으로 차단되면서 최종적으로 전체 단백질 합성이 저해됨을 입증했다.
의미와 전망
이번 연구 성과는 약물 후보 물질의 유효성 검증을 세포 수준에서 신속하게 진행할 수 있는 길을 열었다. 특히 기존 화학 프로테오믹스 연구가 안고 있던 한계인 결합 부위 규명과 실제 효능 검증 사이의 간극을 좁혔다는 평가를 받는다. 수백 개의 표적 후보를 동시에 스크리닝하는 고속 처리가 가능해짐에 따라 차세대 표적 치료제 개발 기간을 대폭 단축할 수 있을 것으로 전망된다. 다만 임상 및 산업 현장에 전면 도입되기 위해서는 극복해야 할 과제들이 남아 있다. 프라임 편집의 교정 효율이 세포주마다 다르기 때문에 모든 유전자에 균일하게 적용하기 까다로운 측면이 존재한다. 아울러 표적 외 편집(Off-target Editing)과 같은 부작용을 극복해야 플랫폼의 정밀성 확보가 가능하다. 약물 후보 물질이 인체 내부와 유사한 환경에서도 동일하게 활성화되는지 살피는 동물 실험 단계의 후속 검증도 과제로 꼽힌다.
Chemical proteomics has identified covalent ligands targeting cysteine residues across many hundreds of human proteins. The functional effects of these liganding events, however, remain challenging to assign at scale. Here we describe ESCAPE (Endogenous Site-specific Competition Assays using Prime Editors), a platform for the site-resolved functional analysis of covalent ligands in cells. In this method, cysteine-to-serine substitutions are generated by prime editing to abrogate covalent ligand-protein interactions, and the impact of these edits on ligand-induced cellular phenotypes is quantified through allele frequency-based resistance scores. Applied to ligandable cysteines mapped by activity-based protein profiling in 50+ proteins, ESCAPE identified multiple covalent ligand-protein interactions that impair cancer cell growth, including azetidine butynamides that target a non-orthosteric cysteine in the RNA helicase DDX49 to disrupt 18S rRNA processing, 40S ribosome assembly, and protein synthesis. ESCAPE thus provides a scalable framework for the functional characterization of covalent ligands targeting structurally and mechanistically diverse proteins.
이번 연구로 개발된 ESCAPE 기술은 신약 개발 초기 단계에서 약물 사장율을 낮추는 핵심 도구로 활용 가능하다. 암세포의 특정 단백질을 표적으로 삼는 신규 항암제 개발 시나리오를 예로 들 수 있다. 신약 후보 물질을 투여했을 때 암세포 성장이 억제된다 하더라도, 이것이 진짜 DDX49 단백질과의 결합 덕분인지 혹은 다른 유사 단백질들과의 오프타겟 결합으로 인한 부작용인지 구별하는 과정이 요구된다. 이때 ESCAPE를 사용해 암세포 내 DDX49의 결합 아미노산만 정밀하게 변이시킨 세포주를 제작하는 방법이다. 만약 약물이 변이된 세포주에서는 항암 효과를 내지 못하고 정상 세포주에서만 효과를 낸다면, 해당 약물은 DDX49만을 표적으로 작동하는 고도로 정밀한 신약 후보 물질임을 직접 증명하게 된다. 이로써 연구 개발 과정에서 불필요한 스크리닝 단계를 대폭 생략하고 유망한 물질에만 역량을 집중하여 신약 허가 성공률을 높인다.