배경

유전체의 특정 위치에 긴 DNA를 정확히 넣는 기술은 유전자 치료와 기능유전체학의 핵심 도구다. 기존 CRISPR–Cas9 기반 상동성 유도 복구(HDR)는 표적 DNA의 이중가닥 절단(double-strand break, DSB)을 전제로 한다. 이 과정에서 큰 결실, 삽입·결실 변이, 염색체 재배열과 p53 매개 DNA 손상 반응이 생길 수 있다. 분열이 느린 세포에서는 HDR 효율도 낮다.

프라임 편집은 Cas9 니케이스와 역전사효소를 결합해 DSB 없이 염기를 교정하지만, 긴 서열을 넣는 데 제약이 있었다. 트윈 프라임 편집이나 재조합효소·전이효소 결합 방식은 삽입 용량을 늘렸으나 편집을 여러 단계로 나누거나 별도의 효소와 인식서열을 요구한다. 서로 다른 변이를 한꺼번에 조사하는 포화 돌연변이 분석에서도 변이마다 복잡한 가이드 설계가 필요했다. 푸단대 연구진은 이런 한계를 줄이기 위해 공여체 상보적 프라임 편집(donor-complementary prime editing, DoPE)을 개발했다. Nature Biotechnology 논문

핵심 발견

DoPE는 양쪽 끝에 짧은 3′ 단일가닥 돌출부를 둔 이중가닥 DNA 공여체(odsDNA), 돌출부와 상보적인 프라임 편집 가이드 RNA 두 개(opegRNA), 핵 이동 신호를 보강한 PE2* 편집기로 구성된다. PE2*가 표적 유전체 양쪽에 공여체 말단과 짝을 이루는 3′ 플랩을 만들면, 약 30뉴클레오타이드 길이의 상보 서열이 공여체를 표적 부위에 연결한다. 재조합효소나 전이효소는 쓰지 않는다.

연구진은 HEK293T 세포의 ACTB-EGFP 리포터에서 108염기쌍 구간을 치환해 형광단백질 변이를 만들고, H9 인간 배아줄기세포와 HeLa 세포에서도 삽입을 확인했다. 합성 단일가닥 올리고뉴클레오타이드 풀과 동일한 opegRNA 한 쌍을 조합하자 EGFP 표적 구간의 아미노산 단위 및 뉴클레오타이드 단위 포화 돌연변이 분석도 가능했다. 가이드 RNA를 변이마다 새로 제작하지 않고 공여체 라이브러리만 바꿀 수 있다는 점이 기존 프라임 편집 스크리닝과 다르다.

삽입 규모는 수십 염기쌍에서 1.4kb, 2.1kb, 3.1kb를 거쳐 최대 12.5kb까지 확장됐다. 1.4kb CMV-EGFP 카세트는 HEK293T 세포의 AAVS1과 TP53 자리, H9 세포의 AAVS1 자리에서 검증됐으며, 12.5kb 삽입도 AAVS1과 TP53 표적에서 확인됐다. odsDNA는 부분 상보적인 합성 단일가닥 DNA를 결합하거나, 말단을 보호한 PCR 산물을 람다 엑소뉴클레아제로 처리해 제작할 수 있었다.

의미와 전망

질환 모델에서는 상염색체 우성 다낭성 간질환과 연관된 PRKCSH의 돌연변이 엑손을 정상 서열로 통째로 교체했다. 연구진은 서로 다른 변이를 지닌 HEK293T 세포와 H9 세포에서 엑손을 개별 또는 동시 치환했고, 편집 뒤 PRKCSH 단백질 발현 회복을 관찰했다. 변이 염기별 교정 도구를 따로 설계하는 대신, 돌연변이가 포함된 엑손 전체를 정상본으로 바꾸는 ‘변이 비의존적’ 전략이다.

다만 이번 성과는 배양 세포 실험에 머문다. 긴 odsDNA와 대형 PE2*를 조직에 함께 전달하는 문제, 세포 유형과 유전체 위치에 따른 효율 편차, 불완전 삽입 및 공여체의 비표적 통합 여부를 더 폭넓게 평가해야 한다. 오프타깃 분석도 컴퓨터로 예측한 후보 부위 중심이어서 전장 유전체 수준의 안전성 검증을 대신하지 못한다. 연구진이 DoPE 관련 특허를 준비 중이라는 이해상충도 기술 비교와 재현성 평가에서 고려할 대목이다.