배경

유전체를 바꾸지 않고 특정 전사체만 줄이는 RNA 표적형 CRISPR는 유전자 기능 연구와 RNA 치료제 개발에서 활용도가 높다. 단일 단백질로 작동하는 PspCas13b와 RfxCas13d(CasRx), 여러 소단위체로 구성된 Csm 등이 대표적이다. 이들 시스템의 RNA 녹다운 효율은 대개 역전사 정량 중합효소연쇄반응(RT–qPCR)으로 평가한다.

문제는 절단 부위를 가로지르는 증폭산물(amplicon)을 설계하는 관행이다. 절단 뒤 남은 RNA 조각이 증폭되는 일을 막을 수 있다는 이유에서지만, 실제 전사체 감소와 측정 과정의 간섭을 구분하지 못할 가능성은 충분히 검토되지 않았다. 미국 존스홉킨스대 연구진은 촉매 활성을 잃은 Csm도 강한 녹다운을 보이는 모순에서 출발해 정량법 자체를 점검했다.

핵심 발견

연구진은 HEK293T 세포에서 핵 내 XIST와 세포질 BRCA1을 표적으로 삼아 야생형 Csm과 리보뉴클레이스 결손형 Csm3-D33A를 비교했다. 절단 능력이 없는 변이체도 RT–qPCR에서는 야생형과 비슷한 녹다운을 나타냈지만, 단백질 분석과 mCherry 유세포분석에서는 감소가 확인되지 않았다. 결합만으로 RNA가 사라진 것이 아니라 측정값이 왜곡됐다는 뜻이다.

오차는 프라이머 위치에 따라 크게 달라졌다. BRCA1에서 가이드 RNA 결합 부위를 가로지르는 증폭산물은 리보뉴클레이스 결손형의 녹다운을 78%로, 근접 상류 증폭산물은 42%로 계산했지만 하류에서는 감소가 없었다. 야생형도 가로지르는 증폭산물에서 92%로 측정된 반면 하류에서는 64%였다. XIST의 경우 가로지르는 위치에서는 야생형과 결손형 모두 약 90%였으나, 하류 측정치는 각각 35%와 14%에 그쳤다. 같은 현상은 PspCas13b와 CasRx에서도 재현됐다.

원인은 RNA 추출 과정에 함께 정제된 가이드 RNA였다. 이 RNA가 표적 전사체에 다시 결합해 역전사효소의 진행을 막으면서 결합 부위와 가까운 상류 영역의 상보적 DNA 합성을 떨어뜨렸다. 합성 가이드 RNA를 역전사 반응에 넣자 농도 의존적으로 오류가 발생했고, 단백질분해효소 K 처리로는 회복되지 않았다. 상류 방해 효과는 거리가 멀어질수록 줄어 약 500뉴클레오타이드 밖에서 사라졌으며, 적합 곡선의 감쇠상수는 170뉴클레오타이드였다.

의미와 전망

연구진은 가이드 RNA에 상보적인 3′ 디데옥시시티딘 말단 안티센스 올리고뉴클레오타이드(ddASO)로 가이드를 격리해 측정값을 회복시켰다. 강한 가닥 치환 능력과 긴 연속 합성 능력을 지닌 역전사효소 ultraMarathonRT(uMRT)를 사용했을 때는 결손형 Csm과 PspCas13b의 가짜 녹다운이 사라졌고, 야생형의 위치별 측정치도 서로 가까워졌다.

실험실에서는 uMRT 같은 진행성·가닥 치환형 역전사효소와 표적 부위를 가로지르는 프라이머를 함께 쓰거나, 기존 효소를 유지한다면 가이드 결합 부위의 하류에서 정량할 수 있다. 단백질 발현, 유세포분석, RNA 시퀀싱 같은 독립적 분석도 병행해야 한다. 다만 RNA 시퀀싱도 RNA 절편화 전에 상보적 DNA를 합성하면 영향을 받을 가능성이 있다.

이번 결과는 기존 RNA 표적 CRISPR 논문의 효율 수치가 모두 틀렸다는 의미는 아니다. 오차의 크기는 가이드 RNA 양과 결합력, 추출법, 역전사 프라이밍 방식에 좌우된다. 페놀·클로로포름 추출은 작은 RNA를 농축해 문제를 키울 수 있으며, 올리고(dT) 프라이밍에서는 결합 부위 상류 전체가 영향을 받을 여지도 있다. 소간섭 RNA(siRNA), 짧은 헤어핀 RNA(shRNA), 안티센스 올리고뉴클레오타이드(ASO) 연구에서도 비슷한 위치 의존성 오류를 다시 살펴볼 이유가 생겼다.