배경: 전달체 선택과 비표적 변이 평가

지질 나노입자(LNP)로 전달한 크리스퍼(CRISPR)-Cas9은 마우스 근육에서 아데노연관바이러스(AAV) 전달보다 표적 부위의 삽입 비율이 낮았다. 다만 인간 세포에서는 특정 가이드 RNA(gRNA)와 관련된 높은 비표적 변이 빈도가 관찰됐다. 연구진은 계산 예측과 DNA 절단 실험, 세포 내 변이 분석을 결합해 이러한 위험을 평가하는 체계를 제시했다.

연구 대상은 뒤센 근이영양증(DMD)의 디스트로핀 유전자 엑손 45다. 두 gRNA로 엑손 건너뛰기를 유도해 단백질 해독틀을 복원하려는 전략으로, LNP에는 Cas9 전령 RNA(mRNA)와 두 gRNA를 봉입했다. DNA를 전달하지 않는 방식은 벡터 DNA 조각의 삽입 위험을 줄일 것으로 기대된다. 그러나 Cas9이 표적 이외의 위치를 절단하는 위험은 별도로 평가해야 한다.

핵심 발견: 마우스 삽입 분석과 인간 세포의 11개 후보

마우스 실험에는 군당 4마리의 리포터 모델을 사용했다. 왼쪽 비복근에 투여하고 28일 뒤 오른쪽에 같은 용량을 투여한 다음, 두 번째 투여 28일 후 양쪽 조직을 분석하는 설계다. 삽입·결실(indel)이 포함된 판독서열 비율은 LNP 첫·두 번째 투여에서 각각 3.60%, 3.55%였고, AAV에서는 10.29%, 0.68%로 나타났다. 반대쪽 근육에 반복 투여한 조건의 결과이므로 같은 근육 재투여나 환자 치료 효과로 확대해 해석할 수는 없다.

삽입이 포함된 판독서열 비율은 LNP에서 두 투여 모두 0.51%, AAV 첫 투여에서 5.69%였다. 기원을 추적한 10염기쌍 초과 삽입 중 LNP에서는 절반 이상이 리포터에 포함된 인간 DMD 엑손 45 서열과 일치했다. Cas9 mRNA·gRNA 유래 서열은 거의 검출되지 않은 수준으로 보고됐으며, 외래서열의 절대적 부재까지 입증한 결과는 아니다.

비표적 분석에서는 예측 도구 13개를 비교했다. 이어 Cas-OFFinder의 서열 기반 예측, 시험관 내 DNA 절단 위치를 찾는 CIRCLE-seq, 정상 핵형을 지닌 인간 유도만능줄기세포(iPSC) 두 계통의 전장유전체시퀀싱(WGS)을 통합하는 접근을 택했다. 두 계통은 같은 건강인에게서 유래했으며 검출 민감도를 높이려고 고용량 LNP를 처리했다. 서로 다른 indel 패턴이 세 개 이상 겹치는 영역을 ‘indel 군집’으로 정의해 배양 중 자연적으로 생긴 변이와 편집 관련 변이 후보를 구분하려는 방법이다.

통합 분석에서 비표적 후보 11개를 확인했고, 이 중 10개가 gRNA #23과 관련됐다. 표적 앰플리콘 시퀀싱에서는 9번 염색체의 한 후보 위치에서 indel 빈도가 58–85%에 달했다. 해당 고용량 처리 iPSC의 특정 위치에서 측정한 삽입·결실 합산 빈도다. 삽입 단독 빈도나 환자의 부작용 발생률을 나타내지는 않는다.

의미와 전망: 교차 검증이 필요한 전임상 안전성 평가

예측 도구들은 민감도와 정밀도를 동시에 높이지 못했다. 계산상 후보, 시험관 내 절단, 세포에서 발생한 변이를 구분해 교차 확인해야 하는 이유다. 비표적 변이 양상은 iPSC와 인간 근육계 세포 사이에서도 달랐고, 조건 간 검출 재현성 역시 제한적이었다.

평균 약 60–80배 깊이의 WGS도 저빈도 변이를 모두 포착하지 못한다. 반복서열에서는 서열 정렬 오류가 후보 판정을 흔들 수 있다는 한계도 남았다. LNP와 AAV의 비교에서는 용량을 엄밀하게 몰수 기준으로 맞추지 못했으므로 전달체 간 차이를 일반화할 때 주의가 요구된다.

이번 연구는 전달체 선택과 gRNA별 위험 평가를 함께 설계할 근거를 제공한다. 환자 효능과 장기 안전성, 규제 승인 요건 충족 여부는 후속 검증 과제다. 연구 설계와 결과는 Molecular Therapy Nucleic Acids 논문에 실렸다.