배경

DNA가 감기는 히스톤 H3의 라이신 잔기는 메틸화·아세틸화 같은 번역 후 변형을 받아 유전자 발현과 염색질 구조를 조절한다. 특정 변형의 기능은 주로 이를 붙이거나 제거하는 효소를 억제해 추론해 왔다. 하지만 효소 하나가 여러 단백질을 변형하거나 비촉매 기능까지 수행하고, 서로 다른 효소가 같은 자리를 보완할 수 있어 관찰된 표현형을 특정 히스톤 표지의 효과로 단정하기 어려웠다.

히스톤 잔기를 직접 치환하면 이런 혼선을 줄일 수 있지만 포유류에서는 구현이 까다롭다. 생쥐의 정규형 H3.1과 H3.2는 각각 9개와 3개 유전자가 여러 염색체 군집에 흩어져 있으며, 비정규형 H3.3도 H3f3a와 H3f3b 두 유전자가 만든다. 기존 염기교정은 편집 창이 좁고 의도하지 않은 주변 염기까지 바뀔 수 있어 여러 H3 사본을 정밀하게 조작하는 데 한계가 있었다. Nature Genetics 원논문의 연구진은 이 문제를 크리스퍼 프라임 편집으로 풀었다.

핵심 발견

연구진은 Cas9 니케이스와 역전사효소를 결합한 PEmax, 불일치 복구를 일시적으로 억제하는 MLH1dn, 강화형 프라임편집 가이드 RNA(epegRNA)를 조합했다. PE2·PE3b·PE4·PE5b를 비교한 결과, MLH1dn을 포함한 PE4와 PE5b가 가장 높은 편집 효율과 가장 낮은 삽입·결실 빈도를 보였다. 이후 독시사이클린으로 PEmax와 MLH1dn 발현을 켜는 생쥐 배아줄기세포주를 제작해 장기적인 불일치 복구 억제의 부담도 줄였다.

H3K23을 아르기닌으로 바꾸는 시험에서는 단일세포 클론의 35%가 80%를 넘는 편집률을 나타냈다. 두 클론은 H3.1의 18개 대립유전자뿐 아니라 H3.2까지 완전히 치환됐으며, H3K23 아세틸화 신호도 거의 사라졌다. 변이를 다시 라이신으로 되돌리는 역편집과 H3K14·K18·K23 세 자리를 한꺼번에 바꾸는 조합 편집도 가능했다. 다만 삼중 편집 효율은 단일 잔기 편집보다 약 4~5배 낮았다.

연구진은 라이신을 아르기닌으로 치환한 세포와 아미노산을 유지하는 동의성 대조군을 비교해 H3K4, K9, K14, K18, K79가 배아줄기세포 적합도에 핵심임을 확인했다. H3K14와 K18의 동의성 편집은 각각 70100%, 7590%에 도달했지만 해당 아르기닌 변이는 고편집 세포가 선택적으로 소실됐다. H3K4R도 반복 형질도입 13회 뒤 36개 클론 가운데 2개만 11~12% 편집에 머물렀다.

정규형 H3의 K18을 바꾸자 H3.3가 프로모터와 인핸서에 더 많이 편입돼 아세틸화 손실을 보상했다. H3.3까지 치환하면 이 재분포가 사라졌다. H3K56R 세포는 DNA 손상제 에토포사이드에 더 민감했으며, H3K27R과 H3K36R 또는 H3K37R을 함께 지닌 세포는 단일 변이보다 집락 형성과 자가재생 능력이 떨어졌다.

의미와 전망

이번 연구는 히스톤 변형 효소가 아니라 변형이 일어나는 잔기 자체를 원래 유전체 위치에서 정밀하게 시험할 수 있는 플랫폼을 제시했다. 정규형과 비정규형 H3 사이의 보상 작용, 서로 다른 라이신 사이의 기능적 상호작용까지 분리해 분석할 수 있다는 점이 강점이다. 암에서 발견되는 히스톤 변이가 세포 성장과 전사, DNA 복구를 어떻게 바꾸는지도 같은 틀에서 검증할 수 있다.

안전성 문제는 남는다. 여러 유전자 좌위를 동시에 겨냥한 클론에서 히스톤 군집의 복제수 손실이 조건별로 4~34% 관찰됐고, 25킬로베이스 결실과 염색체 13 히스톤 군집 한쪽의 메가베이스 규모 소실도 확인됐다. 니킹 RNA를 빼도 모든 좌위에서 위험이 줄지는 않았다. 연구 결과도 배양한 생쥐 배아줄기세포에 국한된다. 사람 세포와 분화 조직, 생체 모델로 확장하려면 장거리 유전체 분석과 독립 클론 검증을 기본 절차로 삼아야 한다.