tRNA 가공 기전을 활용한 DAP 배열, 다중 정밀 유전자편집 설계법 제시
배경
염기교정과 프라임교정은 DNA 이중가닥을 직접 절단하지 않고 특정 염기를 치환하거나 짧은 서열을 삽입·삭제할 수 있다. 단일 유전자 변이 교정을 넘어 다유전자 질환 모델링과 기능유전체학으로 활용 범위가 넓어지면서, 여러 유전체 위치를 한꺼번에 겨냥할 가이드 RNA(gRNA) 발현 체계가 요구돼 왔다.
기존 다중 편집법은 각 gRNA마다 별도 프로모터를 붙이거나, 긴 전사체에서 개별 gRNA를 잘라낼 추가 효소와 인식 서열을 도입하는 경우가 많다. 표적 수가 늘면 DNA 구성체가 커지고 조립 과정도 복잡해진다. 전달체의 적재 용량, gRNA별 발현 편차, 세포 독성도 걸림돌이다. 특히 Cas9은 Cas12a와 달리 배열 형태로 전사된 gRNA를 스스로 가공하지 못해 별도의 분리 장치가 필요했다.
핵심 발견
연구진이 제시한 드라이브앤드프로세스(drive-and-process·DAP) 배열은 gRNA와 전달 RNA(tRNA) 단위를 번갈아 배치한 모듈형 구조다. 단일 전사체가 만들어지면 세포 안의 내인성 tRNA 가공 기구가 각 tRNA를 절단하고, 분리된 gRNA가 Cas9 기반 편집기와 결합해 여러 표적을 동시에 인식한다. 외부 RNA 절단효소를 추가하지 않아도 된다는 점이 설계의 핵심이다.
이번 논문은 DAP 기술의 새로운 치료 효능을 보고한 연구라기보다, 인간 세포에서 다중 염기교정과 프라임교정을 구현하기 위한 설계 원칙과 실험 절차를 정리한 방법론 논문이다. HEK293T 세포를 예시로 배열 구성, 제작, 세포 도입과 편집 결과 평가에 필요한 단계를 제시한다. 기반 연구에서는 75뉴클레오타이드 길이의 인간 시스테인 tRNA를 적용해 염기교정 표적을 최대 31곳, 프라임교정 표적을 최대 3곳까지 동시에 다룬 바 있다.
DAP 배열은 표적 gRNA를 교체해 다시 조립할 수 있으며, 짧은 헤어핀 RNA(shRNA)처럼 gRNA와 크기가 비슷한 RNA도 함께 가공하도록 확장할 여지가 있다. 이에 따라 DNA 서열 교정과 유전자 발현 억제를 한 전사체에서 조율하는 복합 섭동 실험도 구상할 수 있다.
의미와 전망
이 프로토콜은 다중 정밀편집을 연구실에서 재현하고 표적 조합별로 최적화하는 출발점을 제공한다. 여러 변이가 함께 작용하는 심혈관질환, 대사질환, 근육질환의 세포 모델을 만들거나 유전자 간 상호작용을 조사하는 데 특히 적합하다. 짧고 반복 가능한 모듈 구조는 아데노연관바이러스(AAV)나 렌티바이러스처럼 적재 용량이 제한된 전달체를 설계할 때도 이점이 있다.
다만 배양 세포에서 작동한다는 사실이 곧 치료 가능성을 뜻하지는 않는다. 배열이 길어질수록 합성과 클로닝이 어려워지고, 각 gRNA의 가공량과 편집 효율도 표적 서열과 세포 유형에 따라 달라질 수 있다. 여러 위치를 동시에 조작하면 개별 오프타깃뿐 아니라 예상하지 못한 편집 조합과 세포 기능 변화까지 살펴야 한다. 일차세포와 동물모델에서의 전달 효율, 장기 안전성, 배열 안정성을 검증하는 작업이 임상 확장의 관건으로 남는다.
Advancements in base- and prime editing technologies in recent years have offered researchers a plethora of options for introducing precise insertions, deletions, or substitutions into targeted genomic loci. These precision editors' applications have rapidly expanded to the modeling and treatment of polygenic diseases, as well as into the growing field of functional genomics. This has created a need for compact, modular expression systems capable of producing multiple guide RNAs (gRNAs) from a single transcript while preserving high editing efficiency. To address this, we have developed the drive-and-process (DAP) array, a modular architecture composed of alternating gRNA and tRNA units. The DAP array design exploits the cell's endogenous tRNA processing machinery to cleave each tRNA from the array and release individual gRNAs, thereby enabling simultaneous editing at multiple loci following hybridization with Cas9. Here, we outline key design considerations and experimental steps required for the construction and deployment of DAP arrays as multiplex base- or prime editing tools in human cells (e.g., HEK293T). We also highlight how the DAP array can be leveraged to enable efficient processing of gRNAs along with other RNAs of similar size, such as shRNA, potentially broadening its usage in addressing complex biological questions and therapeutic applications that require coordinated genetic perturbation.
제약·바이오 기업은 DAP 배열로 질환 관련 변이 여러 개를 동일한 세포에 한 번에 도입해 복합 유전질환 모델을 제작할 수 있다. 예컨대 환자 집단에서 함께 발견되는 위험 대립유전자 조합을 세포주에 재현한 뒤, 약물 반응과 독성을 비교하는 방식이다. 기능유전체 연구에서는 여러 후보 유전자를 동시에 교정하거나 일부는 shRNA로 억제해 합성치사 관계와 치료 표적 조합을 탐색할 수 있다. 실제 치료제로 발전시키려면 환자 유래 세포에서 표적별 편집률과 전사체 변화를 정량화하고, 전달체 한 개에 들어가는 배열 길이와 편집기 용량을 함께 최적화해야 한다.